单克隆抗体是目前靶标最明确的肿瘤治疗药物,临床应用安仝性好,效果显著,具有巨大的市场。但是应用抗体进行治疗费用昂贵,一个疗程约需20万元,一般患者经济上难以承受。为此,我们实验室于2004年在国际上率先提出并建立全长抗体基因治疗策略,应用复制缺陷型腺病毒携带全长抗体基因,直接在体内(主要是肝脏)表达具有功能活性的伞长抗体,并进入血液循环,达到肿痛治疗目的。该策略省略了抗体制备与纯化的复杂工艺与步骤,因而显著降低了治疗费用。然而由于腺病毒的自身缺陷,该策略仍存在抗体表达量不够高,表达时间较短的缺陷。腺相关病毒(Adeno-associated Viruses,AAV)具有介导外源基因长期高效表达的特点,作为载体已在基因治疗的临床试验中获得成功,因而有望成为全长抗体基因治疗策略的良好载体。然而由于AAV的复制特性,高效、低成本的重组腺相关病毒(rAAV)的制备一直是AAV基础与临床应用领域的一大技术瓶颈。因此,为将腺相关病毒介导的全长抗体基因治疗成功推向临床应用,亟需建立一套稳定高效的rAAV的生产体系。杆状病毒-昆虫细胞表达系统是一种常用的真核细胞表达系统。作为一种昆虫病毒,杆状病毒同样可以像腺病毒或单纯疱疹病毒一样为AAV的复制提供辅助,但又不具有腺病毒和单纯疱疹病毒对人体的毒性,且病毒颗粒大,与AAV病毒颗粒差异显著,便于rAAV的分离纯化,同时其宿主昆虫细胞可以采取悬浮方式进行培养,生产工艺较为成熟,便于rAAV的规模化生产。因此,杆状病毒-昆虫细胞系统有望成为rAAV规模化生产的有效突破口。西妥昔(Cetuximab)单抗是表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor,EGFR)的单克隆抗体,在肿瘤的临床治疗中应用广泛。8型AAV具有强烈的肝脏的亲嗜性,是理想的全长抗体基凶治疗载体。因此,本研究应用AAV8作为携带西妥昔全长单抗基因的载体,构建rAAV8-Cetuximab,并利用杆状病毒-昆虫细胞系统作为rAAV8-Cetuximab的生产制备系统,探索建立一套可用于临床治疗的全长抗体基因治疗策略。　　 本研究主要方法有：⑴构建三个重组杆状病毒载体,分别为含有AAV包装所需的Rep和Cap基因的BAPⅧ、含有Cetuximab全长基因的pABV359-Cetuximab,以及含有Cetuximab全长基因和土拨鼠转录调控元件(WPRE)基因的载体pABV359-Cetuximab-WPRE；⑵三个质粒载体通过DH10Bac细菌内重组并经过蓝白斑筛选得到相应的杆状病毒质粒；⑶在Sf9细胞中包装获得杆状病毒Bac-AAV2RepiCap8i、Bac-Cetuximab,杆状病毒的扩增及实时荧光定量PCR法测定杆状病毒的滴度,检测Bac-Cetuximab在Sf9细胞及HEK293细胞中Cetuximab的表达；⑷Sf9细胞中包装获得rAAV8-Cetuximab及rAAV8-EGFP,并以rAAV8-EGFP为对照,检测制备的腺相关病毒中杆状病毒灭活情况,rAAV8对HEK293细胞的感染活力,及rAAV8-Cetuximab在HEK293细胞中Cetuximab的表达量等。研究结果显示,利用双杆状病毒系统成功包装得到8型腺相关病毒,生产出的病毒rAAV8经HPLC纯化后,实时荧光定量PCR检测病毒载体基因组产量的结果显示,成功获得了高滴度的8型腺相关病毒,100mL摇瓶中可以包装获得1013v.g.的rAAV8病毒颗粒。以相同MOI值感染HEK293,对照病毒rAAV8-EGFP感染HEK293后,结果显示,感染rAAV8-EGFP的HEK293能表达较强的绿色荧光蛋白,说明8型腺棚关病毒感染能力较强。同时,将rAAV8-Cetuximab感染HEK293细胞,96h后分别收集上清蛋白和细胞中蛋白,ELISA检测Cetuximab表达,检测结果显示,细胞中蛋白Cetuximab表达量达到176ng/mL,上清中测得的表达量为49.8ng/mL,但足细胞中与上清中总的Cetuximab表达水平相当,然而,rAAV8-Cetuximab在体外细胞中Cetuximab单抗表达量比较低,需要分析其原因,做进一步改进以提高表达量,同时,rAAV8-Cetuximab在体内表达水平有待进一步检测。