论文部分内容阅读
坏死性肠炎(Necrotic Enteritis,NE)是由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)引起的一类非常重要的肉鸡疾病,发病率可达30%以上,病死率为18%～31%,目前尚未研制出有效的防制疫苗。研究发现某些由强毒产气荚膜梭菌菌株产生的特有分泌蛋白具有一定的免疫原性,肌内注射或者口服免疫这些免疫原蛋白对强毒产气荚膜梭菌攻毒引起的试验性NE有免疫保护作用。因此,本研究目的就是通过分离和鉴定免疫原性分泌蛋白,评价其对NE的重要性及免疫原性;评价构建的携带产气荚膜梭菌免疫原性分泌蛋白基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的免疫效果,从而为NE的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗研制提供一定的依据。(1)通过运用SDS-PAGE蛋白电泳方法分离强毒株和弱毒株的分泌蛋白,然后与阳性NE免疫鸡血清进行Western blot反应,将强毒株特有的3条有较强免疫反应蛋白条带切割,进行质谱分析鉴定。分离鉴定了3种强毒产气荚膜梭菌菌株所特有的分泌蛋白,分别是toxin C.perfringens large cytotoxin(TpeL), Endo-beta-N-acetylglucosaminidase(Naglu)和Phosphoglyceromutase(Pgm)。首次在A型产气荚膜梭菌CP4菌株而且是NE分离株中鉴定了TpeL蛋白,并扩增出TpeL全基因序列,已上传NCBI的GenBank (Accession No. EU848493)。(2)评价鉴定的Naglu和Pgm分泌蛋白对NE的重要性及其作为免疫原的价值。将编码蛋白的基因克隆至pET28a载体中,然后转化至大肠杆菌(BL21star DE3)表达载体进行过量表达,将大肠杆菌表达的重组组氨酸标记的蛋白纯化,分别于7、14、21日龄肌内注射进行免疫试验,并分别用2株产气荚膜梭菌强毒株(CP1,CP4)于4周龄时开始进行为期5 d的攻毒试验,通过肠道病变指数和攻毒期间增重以及血清抗体滴度等进行评价对NE的免疫保护作用。研究表明Pgm对试验性坏死性肠炎有显著的免疫保护作用,但其保护力随着攻毒毒力增加而有所降低。Naglu则只对CP4攻毒所致的坏死性肠炎有免疫保护作用,而对CP1没有保护力。首次检测了Pgm和Naglu的免疫原性及对肉鸡NE的部分保护作用,同时也显示了免疫原的保护力依据不同的攻毒毒株而表现出的差异性。(3)评价2株携带产气荚膜梭菌tHP基因片段的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗对产气荚膜梭菌CP4攻毒引起的肉鸡NE的免疫效果。分别于1、10日龄口服免疫1×108 cfu减毒鼠伤寒沙门氏菌χ9352-tHP或χ9241-tHP,于4周龄开始进行为期5 d的产气荚膜梭菌CP4攻毒。通过尸体的肠道病变指数和攻毒期间体重增重2个指标进行评价免疫鸡群对CP4攻毒的免疫保护作用。结果表明:χ9241-tHP和χ9352-tHP免疫鸡群对CP4引起的试验性NE有显著的免疫保护作用,但是其保护程度与肌内注射免疫tHP或者其他重组免疫原蛋白相比较差。同时,间接ELISA抗体效价测定结果显示,在血清中和肠道均产生了特异性抗沙门氏菌抗体以及抗产气荚膜梭菌抗原,但是小肠黏膜蛋白IgY的滴度高于IgA的滴度,说明IgY在小肠黏膜免疫中占有主导地位。本研究充分证明了通过口服免疫途径,减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗载体成功的运送产气荚膜梭菌重组抗原,并诱导对肉鸡NE的部分免疫保护作用。(4)评价2株携带产气荚膜梭菌tHP基因片段的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗对不同血清型沙门氏菌代表株的免疫效果。分别于1、7日龄口服免疫1×108 cfu减毒鼠伤寒沙门氏菌χ9352-tHP或χ9241-tHP,于14日龄分别用1×106 cfu的5株分别代表B、C、D、E血清型的沙门氏菌毒株进行攻毒。于4周龄的时候剖检,采集样品测定肠道和内脏组织中的攻毒沙门氏菌定殖减少情况。结果发现χ9241-tHP免疫组与对照组相比,显著地减少D型血清型的S. Enteritidis,B型血清型沙门氏菌的S. Typhimurium和S. Heidelberg在肠道内的定殖能力及内脏侵袭力。而χ9352-tHP免疫组对其他血清型沙门氏菌定殖几乎没有减少的迹象。结果表明减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗对NE的有效保护性和抵抗沙门氏菌定殖的有效的保护性是相关的。因此,减毒沙门氏菌菌株作为运送异源性抗原的疫苗载体的选择,应该部分依赖于其是否能够通过减少血清型B族沙门氏菌和血清型D的S. Enteritidis在机体内的定殖而提供对重要血清型沙门氏菌的良好的免疫保护。综上所述,本研究首次分离鉴定了产气荚膜梭菌强毒株的3种免疫原性分泌蛋白,证明了除α-toxin之外的其他分泌蛋白在NE免疫中具有重要作用;研制的沙门氏菌载体疫苗对NE有部分免疫保护作用的同时减少了沙门氏菌的定殖,揭示了沙门氏菌载体的选择对于疫苗免疫保护作用的重要性;将有效控制沙门氏菌定殖作为指导预防和控制NE的弱毒沙门氏菌疫苗载体选择的一个指标,为NE的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗研制奠定了基础。