齐口裂腹鱼肝胰脏中胰蛋白酶的纯化、性质及酶解动力学的研究

被引量 : 4次 | 上传用户:zhangshun1025
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti),隶属于鲤科(Cyprinidae),裂腹鱼亚科(Schizothoracinae),裂腹鱼属(Schizothorax)。广泛分布于长江上游、金沙江、岷江、大渡河及乌江下游等水域,是中国特有的冷水性鱼类。本实验从酶学水平上对齐口裂腹鱼胰蛋白酶的纯化,性质以及酶解动力学消化酶进行了研究,对于研究鱼类消化生理不仅具有重要意义,而且也能够为鱼类配合饲料开发提供相关的理论支持。1.齐口裂腹鱼胰蛋白酶的纯化齐口裂腹鱼的纯化采用三步法:盐析,离子交换色谱法和亲和色谱法。首先将齐口裂腹鱼断脊处死,取出肝胰脏,用4℃双蒸水淋洗干净,用滤纸吸干并称重,按照1:4(W/V)加入含有0.02%叠氮化钠50mM Tris-HCl(4℃、pH8.0)缓冲液,匀浆,过夜激活,然后离心取上清液。上清液用20-60%硫酸铵进行盐析,然后冷冻离心30min (11000rpm,4℃),用相同的缓冲液将沉淀溶解。然后将溶解液进行透析。透析后的粗酶液采用色谱法纯化,首先采用离子交换色谱法,离子交换填料使用Amersham公司的DEAE-SepharoseTM Fast Flow (1.2×20 cm),用含0-0.5 MNaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱,将有胰蛋白酶活性的洗脱峰收集。然后再经亲和色谱进行纯化,亲和色谱使用的是HiTrap Benzamidine FF (high sub)亲和预装柱,用pH3.0的甘氨酸缓冲液洗脱,将有胰蛋白酶活性的洗脱峰收集。采用Bradford法测定各收集组分的蛋白质含量,采用Worthington法测定各收集组分的胰蛋白酶活性,计算产率以及纯化倍数。实验结果显示;齐口裂腹鱼胰蛋白酶的最终产率为18.1%,纯化倍数为456倍。2.齐口裂腹鱼胰蛋白酶性质研究将纯化后的胰蛋白酶进行SDS-PAGE电泳,电泳图最终显示为单一条带,用Bio-Rad凝胶成像系统测得齐口裂腹鱼的胰蛋白酶分子量为25.2KDa。以BAPNA为底物,测得其的米氏常数为0.136mM。设置不同的温度和pH值,采用Worthington法测得齐口裂腹鱼胰蛋白酶的最适反应温度为20℃,最适反应pH为8.0,活性在20℃以下较稳定,pH在7.0-9.0范围内较稳定。用金属离子和抑制剂处理取纯化后的齐口裂腹鱼胰蛋白酶30min,经Worthington法测定显示:Ca2+对齐口裂腹鱼的酶活性有强烈抑制作用。Na+、K+随浓度的提高对齐口裂腹鱼胰蛋白酶的活性具有先激活后抑制的作用。Mg2+、Cu2+对齐口裂腹鱼的酶活力有激活作用。苯甲脒、PMSF、EDTA对齐口裂腹鱼胰蛋白酶活性有抑制作用,其中EDTA具有强烈的抑制作用。而β-巯基乙醇对齐口裂腹鱼胰蛋白酶有激活作用。3.齐口裂腹鱼胰蛋白酶蛋白分解活性的研究在离体条件下测定了纯化的齐口裂腹鱼胰蛋白酶对酪蛋白、牛血清白蛋白、菜粕、棉粕、豆粕和鱼粉的离体消化率和酶解动力学。结果显示,其酶解速度为:鱼粉>菜粕>酪蛋白>豆粕>棉粕>牛血清白蛋白。齐口裂腹鱼胰蛋白酶对酪蛋白的干物质消化率最高,对豆粕干物质消化率最低。
其他文献
本研究通过改编问卷的方式,对我国听障大学生的生活现状进行了调查,并分别从现实和理想两个层面上提取出了我国听障大学生生活质量的核心指标。同时,深入分析了影响我国听障
本文从分析连词在英语使用中的重要性入手,对语系干扰造成连词的误用、多用、少用、错用等情况进行分析,研究以掌握连词词意和连词间区别来规避各类误用。
合作学习是新课程所倡导的新的学习方式之一。在语文教学中实施合作学习,其主要策略是对学生进行科学的分组,引入竞争机制,恰当确定合作学习的内容,改进评价机制等。实践证明
材料的表面与基体内部在结构和性能上都会存在差异,这就要求对薄膜材料的制备及其表征方法有基本的了解.分析了薄膜材料的分类、常见制备方法及其原理,对材料表面的组分、结
我国房地产信用体系正处在初级建设阶段,借鉴美国信用制度建设的成功经验,对我国房地产信用体系的建立有着重要的现实意义。本文介绍了美国信用体系的构成和主要特点,结合我
在诉讼活动中,当事人和事实裁判者除了要审查证据的合法性即证据能力之外,还需要确认证据本身是否具有客观性以及与待证事实是否具有关联性即证据证明力。本文通过综合证据法
研读国内外竞争情报相关文献,特别是最佳实践案例文献,反思我国近20年来竞争情报实践工作的成败得失,结合作者多年来从事竞争情报研究、推介、实际操作的体会,归纳出图书馆开
目的针对抗精神病药物所致便秘,讨论实施中医治疗的效果,为日后的,临床治疗提供参考与指导。方法选择我院2013年2月-2015年2月收治的便秘患者150例为研究对象,经过临床确诊,患者便
母牛子宫内膜炎是最常见的产科病之一,由于母牛所处的地域和饲养管理条件不同,国内外报道的发病率也不一致。为了弄清豫南地区母牛子宫内膜炎的发病规律与适宜的诊治方案,本
近年来,随着我国硕士研究生招生规模的不断扩大及其它原因,硕士研究生的就业形势日趋严峻。因此,及时深入地研究硕士研究生就业中存在的问题,并提出相应的解决对策,这不仅对