目的：本研究通过采用长波紫外线（UVA）辐射人体皮肤成纤维细胞（HSF），诱导细胞发生光老化现象后，采用不同浓度绞股蓝总皂苷（Gyp）含药血清进行干预，观察各组皮肤细胞在增殖活性、ROS含量、细胞凋亡数量以及凋亡相关调控因子Bcl-2，Bax，Caspase-3mRNA和蛋白表达变化，探究Gyp干预光老化细胞凋亡作用相关分子机制，探索Gyp对HSF细胞光老化损伤有明确防治作用新靶点，为绞股蓝作为靶点药物用于防治人体皮肤光老化及相关疾病提供理论基础及实验数据。材料与方法：实验材料：健康SPF级Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠20只，体重200～250g。皮肤成纤维细胞株（HSF）；绞股蓝总皂苷（MUST-11031401）；DMEM高糖培养液；胎牛血清（FBS）；胰蛋白酶；PBS缓冲液；二甲基亚砜（DMSO）；UVA光源（20W），紫外光光度计；MTT；细胞凋亡原位检测试剂盒；水合氯醛；青/链霉素；无水乙醇；75%乙醇；兔抗人Bax、Bcl-2及内参β-actin抗体；HRP标记的羊抗兔二抗；ECL发光试剂盒；Trizol；Bax、Bcl-2及内参引物；PCR仪、电泳仪，凝胶成像分析系统；细胞蛋白提取试剂；BCA法蛋白定量试剂盒；ECL发光液；电热恒温振荡器；酶标仪；凝胶成像分析系统；水平摇床；垂直板电泳装置；电泳仪；转印电泳槽等。实验方法：第一部分Gyp对光老化皮肤成纤维细胞增殖的影响1.绞股蓝总皂苷（Gyp）含药血清制备将20只SD大鼠按随机数字法分为空白血清对照组和Gyp含药血清组。含药血清组给予Gyp粉末生理盐水溶液（生药质量浓度为80mg Kg-1d-1）灌胃，空白血清对照组给予等体积的生理盐水，连续灌胃7d。然后于腹主动脉采血，血液经离心后分离出血清，冻存备用。2.人皮肤成纤维细胞（HSF）培养及光老化模型复制将HSF细胞株消化传代。待倒置显微镜下观察到细胞长满瓶底时，放入冰箱中保存。造模时，取出冻存的HSF细胞，解冻后将细胞悬液移入培养瓶，加入新鲜培养液培养。选取10瓶正常培养的HSF细胞，作为空白对照组（Ⅰ组）。另将50瓶模型细胞随机分为5组，每组10瓶。分别标记为：UVA模型组（Ⅱ组）、空白血清组（Ⅲ组）、低剂量含药血清组（Ⅳ组）、中剂量含药血清组（Ⅴ组）和高剂量含药血清组（Ⅵ组）。取处于对数生长期的HSF细胞，采用UVA照射方法放在紫外灯下照射，进行光老化HSF模型复制。参考相关文献并根据公式UVA剂量=UVA辐照强度×照射时间，经预实验最终确定HSF光老化细胞UVA辐照剂量为36J/cm2。3.Gyp含药血清对光老化HSF细胞增殖活性的影响采用MTT法对各组细胞增殖活性进行检测。取各组细胞悬液，清洗、离心各三次，用台盼兰记数活细胞数为96％，将细胞悬液加入96孔培养板，刺激孔加入Con-A（终浓度为5ug/m1），对照孔加入等量的RPMI-1640培养液，培养72小时。在培养结束前4小时取出培养板，加噻唑兰15u1（5mg／m1），继续培养4小时后弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，在酶联免疫检测仪上490nm波长处测各孔光密度值（OD值），记录数据并对细胞增殖活性进行分析。第二部分Gyp对HSF细胞光老化模型活性氧（ROS）含量和细胞凋亡数量的影响1.细胞中ROS含量检测用荧光探针（DCFH-DA）标记ROS的方法检测UVA诱导细胞ROS生成的作用。接种细胞于96孔板，每孔1.5万个细胞。DCFH-DA孵育：接种24小时后用有糖earle’s液洗两遍，并换上终浓度为25μM DCFH-DA培养箱孵育30min，再以有糖earle’s液清洗。FLUOstarOPTIMA酶标仪检测荧光，488nm激发波长，525nm发射波长。检测DCF的荧光测得细胞内ROS含量。2.HSF细胞凋亡检测采用Tunel法检测HSF细胞凋亡情况。将细胞以PBS漂洗两次，滴加50μlTDT酶反应液，37℃避光湿润反应60min，PBS漂洗3次，采用Tunel法检测试剂盒，FITC荧光染色观测细胞，荧光显微镜观察细胞凋亡形态，计算凋亡细胞平均数并进行统计分析。第三部分Gyp对HSF Bcl-2、Bax和Casapase-3mRNA与蛋白表达的影响1.RT-PCR测定Bcl-2mRNA、Bax mRNA和Caspase-3mRNA的表达接种六组细胞，调整密度，加4mL培养基。六组细胞即空白对照组（Ⅰ组），UVA模型组（Ⅱ组），空白血清组（Ⅲ组）、低剂量含药血清组（Ⅳ组）、中剂量含药血清组（Ⅴ组）和高剂量含药血清组（Ⅵ组）。待细胞90%生长融合后，三个绞股蓝含药血清组分别换成含低、中、高剂量Gyp大鼠含药血清的DMEM培养基，继续培养。收集细胞，提取细胞总RNA，用RT-PCR试剂盒进行逆转录及聚合酶链反应。在波长为254nm的紫外灯下观察实验结果，于凝胶成像系统中采集图像，分别测定目的基因和内参基因条带的积分光密度值，再以目的基因积分光密度值/内参基因积分光密度值的比值作为统计量，进行统计分析。2.Western Blotting测定Bcl-2蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达调整细胞密度，接种到培养瓶，每瓶加5mL培养基。六组细胞即空白对照组（Ⅰ组），UVA模型组（Ⅱ组），空白血清组（Ⅲ组）、低剂量含药血清组（Ⅳ组）、中剂量含药血清组（Ⅴ组）和高剂量含药血清组（Ⅵ组）。细胞90%生长融合后，绞股蓝含药血清组分别换成含低、中、高剂量Gyp大鼠含药血清的DMEM培养基，继续培养24h。收集细胞，PBS漂洗并裂解细胞，测定Bcl-2和Bax蛋白浓度，兔抗人Bcl-2和Bax一抗稀释后，于4℃孵育过夜，TBS/T漂洗3次；HRP标记的羊抗兔二抗稀释后，于水平摇床上室温摇晃1h，再以TBS/T漂洗3次，蛋白信号由ECL发光试剂盒检测，分别测定目的蛋白和内参蛋白条带灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值为统计量，进行统计分析。结果：1. Gyp含药血清对各组HSF细胞增殖活性的影响与空白对照组比较，UVA模型组细胞增殖活性显著降低（P＜0.01）。与UVA模型组比较，Gyp含药血清组细胞增殖活性明显增高（P＜0.05），且高剂量含药血清组干预效果最为明显。中剂量含药血清组细胞增殖活性显著高于UVA模型组和空白血清组细胞增殖活性（P＜0.01）。2.Gyp含药血清对各组HSF细胞ROS含量的影响与空白对照组比较，UVA模型组细胞ROS含量显著升高（P＜0.01）。与UVA模型组细胞比较，Gyp含药血清干预后各组细胞中ROS均显著下调（P＜0.01），且高剂量含药血清组ROS下降幅度最大。中剂量含药血清组细胞ROS含量显著低于UVA模型组和空白血清组细胞ROS含量（P＜0.01）。3. Gyp含药血清对各组HSF细胞凋亡数量的影响电镜下观测到各组细胞凋亡的不同情况。与空白对照组比较，UVA模型组细胞凋亡数量显著上升（P＜0.01）。低、中、高剂量含药血清组细胞凋亡数量比UVA模型组细胞凋亡数量显著减少（P＜0.05，或P＜0.01），其中高剂量含药血清组凋亡减少最为明显。中剂量含药血清组细胞凋亡数量显著低于UVA模型组和空白血清组细胞凋亡数量（P＜0.01）。4.Gyp含药血清对各组HSF细胞凋亡相关因子Bcl-2mRNA和蛋白表达的影响与空白对照组比较，UVA模型组细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），与UVA模型组比较，含药血清组细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达显著上调（P＜0.01），其中高剂量含药血清组Bcl-2mRNA和蛋白上调幅度最大。中剂量含药血清组细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达水平显著高于UVA模型组和空白血清组细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达水平（P＜0.01）。5.Gyp含药血清对各组HSF细胞凋亡相关因子Bax mRNA和蛋白表达的影响与空白对照组比较，UVA模型组细胞Bax mRNA和蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）。与UVA模型组比较，含药血清组细胞Bax mRNA和蛋白表达显著下调（P＜0.01），其中高剂量含药血清组Bax mRNA和蛋白表达水平下调幅度最大。中剂量含药血清组细胞BaxmRNA和蛋白表达水平显著低于UVA模型组和空白血清组细胞Bax mRNA和蛋白表达水平（P＜0.01）。6.Gyp含药血清对各组HSF细胞凋亡下游通路中Caspase-3mRNA和蛋白表达的影响与空白对照组比较，UVA模型组细胞Caspase-3mRNA和蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）。与UVA模型组比较，含药血清组细胞Caspase-3mRNA和蛋白表达显著下调（P＜0.01），其中高剂量含药血清组Caspase-3mRNA和蛋白表达水平下调幅度最大。中剂量含药血清组细胞Caspase-3mRNA和蛋白表达水平显著低于UVA模型组和空白血清组细胞Caspase-3mRNA和蛋白表达水平（P＜0.01）。结论：1.Gyp可显著提升光老化HSF细胞增殖活性，从而显著提高细胞抵抗UVA损伤的能力。2.Gyp可显著抑制细胞内ROS过量生成，帮助细胞清理代谢垃圾，减轻UVA诱导的光老化损伤程度。3.Gyp可显著减少光老化HSF细胞凋亡数量，帮助细胞重新获得修复机会，以抵抗UVA诱导的光老化损伤。4.Gyp可显著缓解HSF光老化模型细胞Bcl-2和Bax基因与蛋白表达的失衡状态，抑制细胞内部相关凋亡信号通路活性，从而减少UVA辐射引起的细胞凋亡，抵抗UVA诱导的HSF细胞光老化现象。5. Gyp可以显著抑制凋亡执行因子Caspase-3的活化，并显著下调HSF细胞在Caspase-3凋亡通路上的DNA转录水平，减少光老化细胞凋亡，对UVA诱导的HSF光老化模型细胞具有保护作用。