砷是常见的、对人类健康危害比较严重的环境污染物之一,可通过皮肤、呼吸道和消化道等途径进入人体,导致身体组织器官发生病变,从而引起多种疾病和癌症的发生。因此,砷毒性研究已经成为大家关注的焦点之一。砷化物能抑制细胞分裂,诱导微核形成,导致部分细胞死亡,但砷化物的毒性作用机制不是很清楚。酵母具有遗传背景简单,生长周期短等优点,是研究真核生物细胞学机制的模式生物。已有研究证明,砷化物可以诱导酵母细胞凋亡,并且伴随着胞内活性氧(ROS)水平的升高,但是关于砷诱导酵母细胞凋亡的调控机制研究尚处在起步阶段,尤其是动物体内相对保守的凋亡抑制基因BCL-2和CED-9在此过程中的作用尚未见报道。本文以酵母细胞为主要材料,研究了亚砷酸钠诱导细胞死亡的作用机制。主要实验结果如下：浓度为1-7 mmol/L的亚砷酸钠可抑制酵母细胞生长,并具有剂量依赖性,其中7 mmol/L亚砷酸钠几乎完全抑制了细胞的生长和分裂。亚砷酸钠可诱导酵母细胞死亡,细胞死亡率随处理浓度的升高和作用时间的延长逐渐升高。利用ROS荧光指示剂DCFH-DA, Ca2+荧光指示剂Fluo-3AM和NO荧光指示剂DAF-FM DA检测胞内ROS、Ca2+和NO水平,发现亚砷酸钠可诱导酵母胞内ROS, Ca2+和NO水平显著升高。一定浓度的抗氧化剂(0.5 mmol·L-1抗坏血酸AsA和200 U·mL-1过氧化氢酶CAT), Ca2+干扰剂(0.5 mmol·L-1 Ca2+螯合剂EGTA和0.1 mmol·L-1 Ca2+通道抑制剂LaCl3)及NO消除剂(0.2 mmol·L-1 NO清除剂c-PTIO和1 mmol·L-1 NO生成抑制剂NaN3)均能降低亚砷酸钠诱导的细胞死亡率,说明亚砷酸钠诱导的酵母细胞死亡与胞内ROS, Ca2+和NO水平的升高有关。以转有凋亡抑制基因BCL-2, CED-9及空载体(对照菌)的酵母为材料,研究了亚砷酸钠对细胞的毒性作用。在不含亚砷酸钠的培养基中,转有BCL-2和CED-9的酵母菌与对照菌生长曲线一致,无明显差异。培养24 h后,3 mmol/L和7 mmol/L处理组中,转基因酵母相对OD600显著高于对照菌,而且细胞死亡率显著低于对照菌,说明亚砷酸钠诱导的酵母细胞死亡可被BCL-2和CED-9调控。经DAPI染色后,处理组细胞出现了染色质凝集,细胞核形状不规则,核碎片等凋亡特征,说明亚砷酸钠可诱导酵母细胞发生凋亡亚砷酸钠诱导酵母细胞线粒体膜电位(△Ψm)下降,胞质中细胞色素c (cyt c)含量升高；2μmol·L-1泛caspase抑制剂Z-Asp-CH2-DCB可以明显降低亚砷酸钠引起的酵母细胞死亡率,说明亚砷酸钠诱导的酵母细胞死亡依赖于线粒体和caspase途径。抗氧化剂AsA和CAT, Ca2+干扰剂EGTA和LaCl3, NO消除剂c-PTIO和NaN3均可抑制亚砷酸钠引起的酵母细胞△Ψm的改变和cyt c含量的升高。酵母菌经°3 mmol/L亚砷酸钠处理6h后,转基因酵母胞内Ca2+水平与对照菌无显著差异,胞内NO水平及cyt c含量显著低于对照菌,△Ψm高于对照菌；转有BCL-2的酵母胞内ROS水平显著低于对照菌,而转有CED-9的酵母胞内ROS水平与对照菌无显著差异。研究结果表明,亚砷酸钠可抑制酵母细胞生长和分裂,诱导细胞死亡。酵母细胞经亚砷酸钠胁迫后可见典型的凋亡特征,而且caspase抑制剂和凋亡抑制基因BCL-2和CED-9均可以明显降低亚砷酸钠引起的细胞死亡率,说明亚砷酸钠可诱导酵母细胞凋亡。砷胁迫期间,酵母胞内ROS、Ca2+和NO水平显著升高,线粒体膜通透性增加,△Ψm下降,cyt c释放,进而激活下游的caspase途径,引起细胞凋亡。CED-9可通过抑制胞内NO的生成,△甲m的改变和cyt c的释放来降低亚砷酸钠引起的酵母细胞死亡率,而BCL-2还可通过降低胞内ROS水平抑制亚砷酸钠引起的酵母细胞死亡。将大蒜金属硫蛋白AsMT2b构建于酵母表达载体pPIC9K或带有酵母金属硫蛋白启动子PCUP1的表达载体pCUP9K,转化毕赤酵母。随机挑取阳性转化子,提取基因组DNA,经PCR法验证可知工程菌构建成功。由于所构建的工程菌带有AsMT2b与GFP的融合蛋白,经诱导表达后,细胞发出绿色荧光；用SDS凝胶电泳检测蛋白表达,可见与目的蛋白大小相符的条带,说明蛋白可正常表达,获得工程菌pPIC9K-AsMT2b-GFP和pCUP9K-AsMT2b-GFP。以工程菌pCUP9K-AsMT2b-GFP和对照菌pCUP9K为材料,研究AsMT2b在亚砷酸钠胁迫酵母细胞过程中的作用。细胞生长率及死亡率检测结果显示,50μM-1000μM的亚砷酸钠可抑制毕赤酵母细胞生长和分裂,诱导部分细胞死亡。在含有相同浓度亚砷酸钠的处理组中,转有AsMT2b的工程菌细胞死亡率显著低于对照菌,但与对照菌的OD600无显著差异。此外,我们以工程菌pPIC9K-AsMT2b-GFP和pCUP9K-AsMT2b-GFP,对照菌pPIC9K, pCUP9K和GS115为材料,采用平板点样法研究酵母细胞在含有一定浓度As3+,Cu2+,Cr6+和Cd2+的固体培养基中的生长情况。结果发现,在金属离子胁迫下,转有AsMT2b的工程菌生长情况明显好于对照菌,说明AsMT2b的表达可以提高酵母细胞对As3+, Cu2+, Cr6+和Cd2+的抗性；在4种不同金属离子的胁迫下,工程菌pCUP9K-AsMT2b-GFP生长状况明显优于pPIC9K-AsMT2b-GFP,说明As3+, Cu2+,Cr6+和Cd2+对pCUP9K-AsMT2b-GFP均有一定的诱导作用。AsMT2b的表达可降低亚砷酸钠引起的酵母细胞死亡率,提高酵母细胞对As3+, Cu2+, Cr6+和Cd2+的耐受性,推测AsMT2b可通过螫合金属离子降低金属离子引起的细胞死亡率。砷化物可抑制蚕豆和洋葱根尖细胞分裂,诱导微核率和MDA含量升高；高浓度的砷可导致植物根尖细胞死亡,出现核固缩现象。在一定浓度范围内,微核率与砷浓度间呈显著正相关,微核率在一定程度上能够反映水体中的砷污染程度。因此,植物根尖微核技术可用于检测环境中砷污染的水体。