SFLT-1基因修饰的骨髓间充质干细胞对H2O2损伤视网膜微血管内皮细胞的作用研究

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背景:视网膜及脉络膜新生血管性疾病是导致视力损害和失明的主要原因,主要由氧化应激和炎症反应造成,目前主要治疗方法是通过玻璃体腔反复多次注射抗血管内皮生长因子(VEGF)药物,可能会导致眼压升高、眼内炎等,且增加了患者的经济负担。大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)可分泌多种神经营养因子,通过旁分泌发挥神经营养及抗氧化损伤的作用。可溶性血管内皮生长因子受体1(SFLT-1)可有效抑制VEGF,阻断新生血管形成。视网膜微血管内皮细胞(RMECs)是视网膜新生血管性疾病发生氧化应激及炎症反应的重要参与者。本研究通过构建SFLT-1过表达的腺病毒感染BMSCs,观察其对氧化损伤RMECs的作用。目的:体外建立BMSCs与人RMECs共培养体系,评估过表达SFLT-1基因的BMSCs对过氧化氢(H2O2)损伤RMECs的影响。方法:体外提取、培养SD大鼠BMSCs,并进行流式鉴定,成骨、成脂及向内皮细胞诱导。使用SFLT1基因过表达的腺病毒感染BMSCs,并进行RT-qPCR、ELISA检测其mRNA与蛋白分泌情况。体外培养人视网膜微血管内皮细胞,并进行vWF鉴定;使用不同浓度的H2O2进行诱导损伤,通过CCK8、TUNEL测定其最佳损伤模型浓度。本实验分为4组:正常内皮细胞组(Normal)、H2O2诱导损伤内皮细胞组(H2O2)、GFP-BMSCs与内皮细胞共培养组(GFP-BMSCs)、SFLT1-BMSCs与内皮细胞共培养组(SFLT1-BMSCs)。共培养24h、48h后,观察各组氧化损伤情况,ELISA检测各组VEGF分泌情况,各组MDA、SOD变化情况,炎症因子TNF-α、IL-1β分泌情况,以及神经营养因子BDNF、CNTF的分泌情况,评估GFP-BMSCs与SFLT1-BMSCs对RMECs的影响。结果:体外成功提取、培养大鼠BMSCs,流式细胞鉴定结果显示CD44、CD90、CD29、CD73为阳性,CD34、CD11b/c、CD45为阴性,符合MSCs定义标准。成脂诱导、成骨诱导、向内皮细胞诱导均成功。成功构建过表达SFLT1基因的腺病毒载体,并以MOI值为400感染BMSCs,检测到BMSCs中SFLT-1 mRNA的表达及SFLT-1蛋白的持续分泌。人RMECs经过vWF免疫荧光鉴定结果为阳性;CCK8、TUNEL观察H2O2诱导RMECs缺氧损伤随药物浓度增加,细胞活力下降,并出现细胞凋亡现象,取最佳诱导浓400μmol/L进行后续实验。共培养24h、48h后,与H2O2损伤组相比,GFP-BMSCs组与SFLT1-BMSCs组RMECs上清液中VEGF分泌量明显下降,细胞内MDA水平下降,SOD水平升高,且SFLT1-BMSCs组较GFP-BMSCs组各指标水平变化更明显。GFP-BMSCs组与SFLT1-BMSCs组RMECs上清液中炎症因子TNF-α和IL-1β水平下降,SFLT1-BMSCs组较GFP-BMSCs组下降水平无差异。神经营养因子CNTF和BDNF分泌增加,且GFP-BMSCs组较SFLT1-BMSCs组增加更明显。结论:SFLT1基因修饰的BMSCs有效降低H2O2诱导RMECs的VEGF、炎症因子及氧化因子的水平,提高神经营养因子与抗氧化因子的水平,且SFLT1与BMSCs的协同作用优于单独BMSCs的作用,均有效保护氧化损伤的视网膜微血管内皮细胞。
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