研究目的癌症仍然是困扰人类的世界性医学问题,探讨癌症发生发展的分子机制对于认清癌症本质、攻克癌症难题具有非常重要的意义。同时,建立与肿瘤相关的生物标志物的检测方法,能为癌症的早期筛查提供重要的方法学基础。因此,本论文的研究目的有以下几个方面:(1)研究结直肠癌细胞IRS1和p110αE545K的特征及其对下游信号的影响,探究这两种蛋白在结直肠癌发生发展过程中的作用;(2)研究PI3K调节亚基p85β,在含有p110αE545K突变的结直肠癌中可能存在的新的生物学功能及其分子机制;(3)发掘发挥该生物学功能的关键基因信息,并探讨其与p85β生物功能的相关性;(4)建立检测与癌症发生相关的DNA氧化性损伤生物标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)和肿瘤标志物叶酸受体(FR1)的简便准确的分析方法,为癌症的早期诊断和筛查提供方法学基础。研究方法1.在人结直肠癌DLD1细胞和p110α只含有E545K突变型等位基因的DLD1细胞(以下简称DLD1 Mut-only细胞)的基础上,分别将IRS1基因敲除。利用蛋白印迹和表型分析的方法,比较敲除IRS1前后,细胞相关蛋白的表达水平变化及细胞凋亡、平板集落和软琼脂集落形成的能力,探究IRS1对癌细胞的重要性。2.在DLD1 Mut-only细胞的基础上,构建p110αD933A突变及p110αE545K基因敲除细胞系。利用蛋白印迹和表型分析的方法,比较突变及敲除p110α前后,细胞相关蛋白的表达水平变化及细胞凋亡、平板集落和软琼脂集落形成的能力,探究p110α对癌细胞的重要性。3.在人结直肠癌DLD1细胞、只含有野生型p110α等位基因的DLD1细胞(以下简称DLD1 WT-only细胞)、DLD1 Mut-only细胞、HCT116细胞、RKO细胞以及SW480细胞中,利用免疫共沉淀的方法,探讨p110α、IRS1、p85a及p85β的相互作用关系。4.在DLD1 Mut-only细胞基础上,将p85β基因敲除,构建p85βKO细胞系。通过表型分析(包括细胞凋亡、平板集落和软琼脂集落形成、裸鼠异种移植瘤模型)研究p85β基因敲除前后细胞表型的变化,从而确定p85β的生物学功能。在此基础上,通过蛋白印迹技术研究与p85β生物学功能相关的分子机制。5.在DLD1 WT-only细胞、DLD1 Mut-only细胞、HCT116 WT-only细胞(p110α只含有野生型等位基因的HCT116细胞)、HCT116 Mut-only细胞(p110α只含有H1047R突变型等位基因的HCT116细胞)中,利用免疫荧光染色及激光共聚焦技术,确定p85β的细胞定位情况。6.利用“c NLS Mapper”预测p85β的关键核定位信息,在p85βKO细胞的基础上,构建HA标记的野生型p85β及HA标记的关键核定位信号突变的p85β过表达细胞系。通过免疫荧光染色及激光共聚焦技术,对预测得到的p85β的关键核定位信息进行验证。7.在DLD1基础上,利用CRISPR-Cas9技术构建关键核定位信号突变的p85β基因敲入细胞系。通过裸鼠异种移植瘤模型,在人结直肠癌DLD1亲代细胞上,验证与p85β致癌功能相关的关键基因信息。8.利用抗原抗体的特异性反应及免疫胶体金技术,通过吸光光度法建立与肿瘤相关的生物标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)的分析方法。9.利用抗原抗体的特异性反应及免疫胶体金技术,通过共振瑞利散射法建立肿瘤标志物叶酸受体(FR)的检测方法。研究结果在DLD1或DLD1 Mut-only细胞基础上,将IRS1基因敲除后,p110αE545K的蛋白表达也随之降低,而p85β的表达量不受影响。IRS1基因敲除后,下游p AKT表达量下降,而对MAPK信号通路无影响。敲除IRS1基因可以促进癌细胞发生自主性凋亡,抑制癌细胞的平板集落和软琼脂集落的形成能力,从而降低癌细胞的恶性程度。p110αE545K基因突变及敲除后,IRS1和p85β的表达量均不会受到影响,下游p AKT表达量下降,而对MAPK信号通路无影响。从表型分析结果看出,p110αE545K基因敲除也可以降低癌细胞的恶性程度。在DLD1 WT-only和DLD1 Mut-only两种癌细胞系中,p85a均结合在p110α上。在DLD1 WT-only癌细胞系中,p85β同时与p110α及IRS1相结合,发挥其调节亚基的作用。而在DLD1 Mut-only癌细胞系中,p85β从p110αE545K中解离下来,且解离下来的p85β也不再与IRS1发生相互结合。p85β从p110α解离下来的事实只特异于含有p110αE545K突变的细胞系,在其他人结直肠癌细胞中没有该现象。为研究p85β的生物学功能,我们在含有p110αE545K突变的人结直肠癌细胞系中构建了p85β基因敲除细胞系。p85β基因敲除后,癌细胞的凋亡数增加、平板集落和软琼脂集落数下降、在裸鼠两侧接种的异种移植瘤的形成能力降低。这些结果表明游离的p85β在含有p110αE545K突变的肿瘤细胞中也具有了一定的致癌活性。分子机制研究显示,p85β的该项功能可能与JNK/c-jun信号通路有关。通过免疫荧光染色对p85β进行细胞定位时发现,只有在含有p110αE545K突变的人结直肠癌细胞系中,解离下来的p85β进入了细胞核,而在其他细胞中,p85β均位于胞浆。对p85β的关键核定位信息分析显示,位于整个p85β氨基酸序列第477和478位的赖氨酸和精氨酸“KR”对p85β在p110αE545K突变型癌细胞中入核的行为非常关键。将这两个关键氨基酸突变成“AA”(两个丙氨酸),然后在p85βKO细胞基础上分别过表达野生型p85β和突变型p85β,发现野生型p85β质粒稳转后,p85β仍然入核;而突变型p85β质粒稳转后,p85β则在胞浆。裸鼠异种移植瘤模型结果表明,在人结直肠癌DLD1细胞基础上,将p85β基因的“KR”突变成“AA”后,癌细胞的成瘤能力明显减弱。以上结果说明,“KR”序列确实是p85β的关键入核信号,且该信号对p85β的致癌性能关系重大。另一方面,对与肿瘤相关的生物标志物8-OHd G的检测结果显示,免疫胶体金吸收波长红移的波长数和8-OHd G的浓度呈很好的线性关系,检测范围0.25-5.00mg/m L,最低检出限25 ng/m L。且随着8-OHd G的浓度的增大,胶体金的颜色从红逐渐变紫甚至变蓝,根据颜色的变化实现了8-OHd G的半定量可视化检测。透射电镜结果显示,波长的移动和颜色的变化与胶体金聚集状态有关。通过共振瑞利散射的信号增强和浓度之间的线性关系实现了对叶酸受体FR1的简单快速定量测定。线性范围0.50-37.50 ng/m L,最低检出限0.05 ng/m L。利用共振瑞利散射作为响应信号,大大提高了检测方法的灵敏度。结论在结直肠癌分子机制的研究中,我们发现IRS1及p110αE545K对于DLD1癌细胞形成的肿瘤的发生发展至关重要,二者通过AKT信号通路发挥致癌作用。在含有p110αE545K突变的人结直肠癌DLD1细胞中,p85其中的一种亚型p85β从p110αE545K蛋白上特异性地解离下来,解离下来的p85β也不再与IRS1结合。游离的p85β特异性的进入了含有p110αE545K突变的DLD1癌细胞的细胞核中。入核后的p85β本身也具有了一定的致癌活性,且p85β的入核行为及致癌活性与其序列中位于第477位和478位的“KR”具有重要相关性。在与肿瘤相关的生物标志物的分析方法方面,我们成功建立了两种标志物(8-OHd G和FR1)的检测方法,该方法具有快速方便,操作简单,选择性好等优点。本论文的创新性(1)发现了不与p110α结合的独立的p85β的新的生物学功能,并揭示了发挥该新生物学功能的关键基因信息,为肿瘤药物设计筛选和临床治疗提供一个极具前景的新靶点。(2)建立了两种与肿瘤相关的生物标志物的简单快速的分析检测方法,为癌症的早期诊断提供重要的方法学理论依据。局限性及未来计划本文仍存在局限性,表现在:(1)对基于DLD1构建的p85βKR突变基因敲入细胞的表型分析不够全面;(2)对可能影响p85β生物学功能的分子机制的研究不够深入明晰;(3)实验建立的对8-OHd G的检测方法的灵敏度有待进一步提高。针对以上不足,未来将对实验进行完善和优化。(1)对p85βKR突变基因敲入细胞进行多种表型分析,如细胞凋亡、集落形成及软琼脂等实验;(2)查阅文献,进一步分析研究影响p85β生物学功能的下游信号通路,找到能合理解释p85β致癌活性的分子机制;(3)尝试对纳米材料进行其他修饰表征,提高检测指标的灵敏度。