水稻第6染色体S5区基因克隆及分子生物学研究

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水稻广亲和品种在与籼稻和粳稻杂交中能产生正常育性的子代,使籼稻和粳稻亚种间的育性屏障有望突破,并使在水稻育种工程中发展亚种间杂交成为可能。根据经典遗传学定位,与广亲和性相关的主效基因位于第6染色体的S5区。在前期工作中,我们通过定位克隆在水稻S5座位处分离到一cosmid克隆R2I19,并以此为依据构建了一586kbBAC(JS5-BC)重叠群。通过搜索FL-cDNA数据库(KOME,TheRiceFull-LengthcDNAConsortium,2003)以及水稻EST数据库,我们在JS5-BC重叠群中注释了46个基因座。在本论文中,通过生物信息学的初步分析,针对586kbBAC(JS5-BC)重叠群中的基因进行克隆,通过文库构建、筛选及RT-PCR获得了3个全长的cDNA克隆,分别命名为OsGAP-1,OsDUF1296,OsDSP;并通过RNA沉默技术对其在水稻体内的生物学功能进行了研究。首先以pBluescriptSK(M13-)和植物双元载体pCAMBIA1301为骨架构建了中间载体,pCRiPromoter,来源于Gus基因的约200bp的内含子片段被放置于不同启动子和胭脂碱合成酶终止子之间,基因的正向片段连接入pCRiPromoterMCS1位点中,相同的片段以反向连接入pCRiPromoterMCS2位点中,从而转录后形成双链RNA结构。载体的沉默效应通过在转基因烟草中进行GUS组织化学和荧光定量检测,结果表明该RNA沉默载体可有效进行植物体内基因沉默。OsGAP-1基因编码一受体样GPI锚定蛋白,可能通过GPI锚锚定在细胞膜的特定区域。OsGAP-1基因由4个内含子与5个外显子组成,推算的编码蛋白由409个氨基酸残基组成,并预测含有一LysM结构域,该结构域被认为是一种受体元件。将该基因序列提交NCBI数据库,得到接受并获得序列号AY603381。
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