[背景]肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma)是我国最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度相对较高,预后较差。目前,肝细胞肝癌的主要治疗措施为化放疗和手术治疗,但存在化放疗抵抗和手术后肿瘤复发的风险。肿瘤干细胞概念的提出不仅解释了肿瘤化放疗抵抗、转移、复发的机制,更为人们选择合适的靶点采用免疫治疗方法预防肿瘤的化放疗耐药、复发和转移提供了新的思路。减毒李斯特菌因其能有效激活机体免疫应答并具有较高的安全性,成为肿瘤疫苗的良好载体。本研究制备减毒重组李斯特菌肿瘤疫苗Lmdd-CD24,阐明该疫苗在肝癌移植瘤小鼠中的免疫作用及疗效,并探讨其在肿瘤微环境中的免疫调控机制,为后续开发肝癌干细胞疫苗提供重要的临床前资料。[方法]1)确定肝癌干细胞表面标记分子CD24为本课题免疫治疗肝癌,预防肝癌复发与转移的合适靶抗原。2)体外实验研究过表达CD24蛋白对人肝癌细胞株的凋亡及迁徙性的影响。将CD24表达于人肝癌细胞株HepG2,收集细胞并用碘化丙啶和AnnexinV染色,流式检测细胞凋亡率,证实CD24分子能够减少肿瘤细胞凋亡,其机制主要是降低Caspase-9水平,升高Caspase-3水平,同时采用划痕实验,对比HepG2和HepG2-CD24细胞的迁移率,发现CD24分子能够促进肿瘤细胞的迁移。3)将该目的基因CD24通过分子克隆技术插入至穿梭质粒载体PSKV7中,通过一系列同源重组技术制备重组减毒李斯特菌疫苗Lmdd-CD24,证实该疫苗能够持续、稳定、有效地表达CD24蛋白。4) Lmdd-CD24疫苗免疫接种小鼠体内后具有较高的安全性,主要分布于脾脏中,且能被单核巨噬细胞俘获,三天后减毒李斯特菌基本被清除,未引起明显的炎症反应和组织器官损伤。5)从IFN-γ分泌水平,产IFN-γ CD8+T淋巴细胞数量,产细胞因子IL-4和IL-10T淋巴细胞数等实验结果证实该疫苗显示出较强的免疫原性,能对肝癌干细胞抗原表位产生特异的、不同程度的应答效果,能够有效地激活机体的Thl和Th2细胞。6)进一步建立高表达CD24的HCC移植瘤转基因小鼠动物模型,该疫苗治疗组和预防组免疫接种后均能抑制转基因小鼠移植瘤生长,提高荷瘤生存率,延长荷瘤生存期。7)流式细胞仪及免疫组化检测结果显示疫苗免疫后肿瘤组织中调节性T细胞(Tregs)数量减少。8) ELISPOT、体外杀伤试验结果显示肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)中CD8+T细胞对各肿瘤抗原表位产生应答作用,诱导的抗原特异性CTL能有效的杀伤靶细胞。[结果]本研究结果表明：CD24作为肝癌干细胞表面的标记分子,能够减少肝癌细胞的凋亡,促进肝癌细胞的转移。通过分子生物学技术,构建减毒李斯特菌,发现其能够持续稳定的分泌CD24蛋白,并有较高的安全性,进入小鼠体内后主要分布于脾脏和肝脏,不引起明显组织和器官损伤。该疫苗能够有效激活机体Thl和Th2细胞产生免疫应答,同时减少肿瘤组织中调节性T细胞(Tregs)的数量,因而能够抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长小鼠的生存期。[结论]减毒李斯特菌Lmdd-CD24疫苗安全有效,能诱导机体产生特异性免疫应答,将来有可能应用于临床实践中。