[目的]椎间盘退变(Intervertebral degenerative disc,IVDD)是脊柱退行性疾病的病理基础,引起下腰痛的重要原因。目前,临床上针对IVDD的治疗手段主要以缓解临床症状为主,并不能阻止、延缓或逆转IVDD病理进程,尚无有效的防治措施。IVDD是一个繁琐的过程,它的发生及复发率高且危害大,受多要素、复杂机制调节,对IVDD发生的具体机制尚不清楚。研究证明髓核细胞的凋亡和数量减少会导致细胞外基质合成减少,破坏细胞外基质合成与降解动态平衡,可导致椎间盘退变。在脊柱椎间盘退变的进程中,炎症反应是其一个主要的病理变化,非编码小RNA(MicroRNAs、miRNAs)参与调控细胞的增殖、分化、凋亡和炎症反应。但是,MicroRNAs在炎症反应条件下如何参与调控髓核细胞外基质降解的作用还不完全清楚。因此,本研究旨在:体外培养髓核细胞及构建髓核细胞炎症损伤模型,研究miRNA-503在IL-1β引起的人椎间盘髓核细胞外基质降解中的作用,为防治椎间盘退变提供理论及实验依据。[方法]1.第一部分,(1)收集10例因椎间盘突出症在椎间孔孔镜下摘除的椎间盘髓核标本[Pfirrmann’s核磁共振评分3-4级,病史1年以内,平均年龄为26岁,(年龄范围为22-35岁)];首先采取酶消化法从分离的新鲜髓核组织中提取髓核细胞进行培养,观察细胞的形态结构和生物学特性,通过甲苯胺蓝染色和荧光定量PCR检测细胞角蛋白19对髓核细胞进行鉴定;(2)用培养的髓核细胞在体外构建椎间盘髓核细胞炎症损伤模型,使用IL-1βOng/ml、IL-1β1ng/ml、IL-1β10ng/ml对髓核细胞进行刺激,在4h、8h、16h、24h、48h应用CCK-8方法检测炎症因子IL-1β对椎间盘髓核细胞活力产生的作用;(3)用IL-1βOng/ml、IL-1β1Ong/ml对髓核细胞进行刺激,在4h、8h、16h、24h、48h应用Hoechst33258法检测髓核细胞的凋亡情况,应用双染流式细胞(FITCAnnexin V/PI)流式细胞仪和qRT-PCR分析检测髓核组织中细胞凋亡率的变化,应用荧光探针(DCFH-DA)检测髓核细胞内活性氧的含量。2.第二部分,使用IL-1β(10ng/ml,16h)刺激髓核细胞后,应用实时荧光定量PCR 检测 miR-503、MMP-9、ADAMTS-4、collagenⅡ、TIMP-3、caspase3 的表达量。3.第三部分,使用miR-503mimic、miR-503antagomir及它们的阴性对照物转染髓核细胞,转染后加入IL-1β(10ng/ml,16h),应用流式细胞术检测细胞凋亡率和荧光定量PCR检测MMP-9、TIMP-3的表达量。[结果]1.第一部分实验结果:(1)分离培养椎间盘髓核细胞,显微下观察细胞形态为长梭形、多角形,甲苯胺蓝为阳性表现,角蛋白19在人的髓核细胞中明显表达上调;(2)发现IL-1β(10ng/ml)组OD值明显降低(P<0.01),说明髓核细胞被IL-1β(1Ong/ml)诱导损伤后,髓核细胞的活力明显减退,呈时间依赖梯度;(3)IL-1β(10ng/ml,16h)刺激髓核细胞出现了明显的凋亡,细胞核碎裂、核固缩,细胞凋亡率明显增加(P<0.01);IL-1β(10ng/ml、16h)组髓核细胞内ROS含量较对照组明显增多(P<0.01),髓核细胞内ROS大量产生;说明IL-1β(10ng/ml、16h)时髓核细胞凋亡率最合适,用于后续实验。2.第二部分实验结果:IL-1β(10ng/ml、16h)作用于体外培养的髓核细胞后,MiR-503、MMP9、ADAMTS4、Caspase3mRNA的相对表达量较对照组出现了上调(P<0.05);COL2A1、TIMP3mRNA的相对表达量较对照组出现了下调(P<0.05)。3.第三部分实验结果:IL-1β+miR-503 mimics 组较 IL-1β+miR-503 组的 MMP-9 mRNA 表达量出现了上调(P<0.05);IL-1β+miR-503 mimics 组较 IL-1β+miR-503组的TIMP-3 mRNA表达量出现了下调(P<0.05)。[结论]1、探索出了 IL-1β在10ng/ml 16h诱导髓核细胞凋亡作用最明显2、miR-503在IL-1β诱导的人椎间盘退变中明显高表达3、miR-503在IL-1β诱导下调控人椎间盘髓核细胞外基质降解