论文部分内容阅读
目的：观察缺氧/复氧后体外培养星形胶质细胞活化增殖变化及通过特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号传导通路后p38磷酸化水平变化，探讨p38MAPK信号传导通路对星形胶质细胞缺氧/复氧后活化增殖的影响。 方法：体外培养新生24小时内Sprague-Dawley(SD)大鼠脑皮质星形胶质细(astrocyte，AC)，传至第3代纯化后行神经胶质纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidprotein，GFAP)特异性抗体免疫荧光鉴定。应用三气培养箱以95％N2、5％CO2造成细胞缺氧并记缺氧时间，缺氧后放入37℃、5％CO2培养箱中复氧培养并记录时间。将AC分为(1)正常对照组(N组)：细胞于CO2培养箱中持续培养。(2)抑制剂SB203580对照组(SB组)：SB203580终浓度为10μmol/L，细胞于CO2培养箱中持续培养。(3)缺氧/复氧组(H/R组)：时间点为缺氧4h，8h，复氧6h，12h，24h，48h。(4)缺氧/复氧+抑制剂SB203580组(H/R+SB组)：SB203580(终浓度为10μmol/L)于缺氧前30min加入，时间点为缺氧4h，8h，缺氧后复氧6h，12h，24h，48h。实验各组：MTT方法测定细胞活力，Brdu/GFAP免疫荧光双标染色及流式细胞法检测细胞周期观察细胞增殖及凋亡情况，蛋白免疫印迹法(Western-blot)法检测p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表达情况及ELISA法检测TNF-α含量。采用SPSS16.0统计软件包进行数据分析。 结果：1.体外培养AC及GFAP鉴定结果：AC传至3代后，经GFAP免疫荧光染色鉴定细胞纯化度97％以上。2.MTT法检测细胞活力：(1)N组与SB组比较细胞活力无明显改变。(2)H/R组与N组比较细胞吸光度下降，细胞活力减低，随着时间延长细胞活力下降明显，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)H/R+SB组与N组比较细胞吸光度下降，与H/R组比较吸光度增加，细胞损伤减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。3.ELISA TNF-α检测：(1)N组与SB组TNF-α水平无显著变化(2)缺氧复氧干预后，H/R组TNF-α水平与N组比较含量上升，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)用SB203580阻断p38MAPK通路后，SB+H/R组TNF-α水平较N组升高，较H/R组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。4.Brdu/GFAP细胞免疫荧光检测AC增殖结果：(1)N组和SB组细胞未见明显核染色。(2)H/R组缺氧时未见明显核染色，复氧后随着时间延长Brdu/GFAP双阳性细胞数增多。(3)H/R+SB组与H/R组比较Brdu阳性/GFAP阳性细胞数增多，差异有统计学意义(P<0.05)。5.流式细胞仪检测AC凋亡结果：(1)N组与SB组凋亡率差异无统计学意义。(2)H/R组H4h，H8h，H8R6h AC与N组比较凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)H/R+SB组H8h，H8R6hAC凋亡减少，与N组，H/R组比较差别有统计学意义(P<0.05)。6.Western-blot半定量检测结果：(1)各组间p38水平差别无统计学意义(P>0.05)。(2)H/R组p-p38缺氧后表达量增多，随着复氧时间延长有减少趋势；与N组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)H/R+SB组：p38MAPK特异性抑制剂降低p-p38表达水平，与H/R组相比差异有统计学意义(P<0.05)。7.流式细胞仪检测AC周期结果：(1)N组与SB组比较差异无统计学意义，H8R6h时间点H/R组S期细胞较N组增多，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)H8R6h时间点H/R+SB组与H/R组比较S期细胞数增多，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论：1.缺氧/复氧可引起星形胶质细胞活化增殖。2.SB203580特异性阻断p38MAPK信号传导通路能抑制缺氧/复氧刺激引起的p38磷酸化。3.SB203580特异性阻断p38MAPK信号传导通路可以促进星形胶质细胞反应性增殖并抑制其凋亡，可能与p38MAPK调控细胞周期有关。