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尖锐湿疣(Condyloma Acuminatum，CA)主要是由人类乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)6/11型感染引起的泌尿生殖道皮肤粘膜的良性增生性疾病，发病率逐年上升并已成为全球最常见的性传播性疾病之一。由于至今仍缺乏有效的防治手段，使得临床上CA往往顽固难治且极易复发(复发率高达28％到65％)，造成患者人数不断增长。近年的研究表明临床上CA的迁延不愈和顽固难治可能与HPV很难有效激发机体尤其是感染局部的免疫应答有关。众学者正在试图通过使用上调机体抗病毒免疫的药物来清除HPV以治疗CA及HPV感染相关疾病，如应用干扰素、白介素-2和咪奎莫特等药物治疗CA，但这些药物均为非病毒特异性，故临床疗效仍有一定的局限性。因此认为，对HPV感染的治疗关键是加强病毒抗原与免疫细胞间的接触和抗原的呈递，激发机体特别是感染局部的特异性细胞免疫。 树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是功能最强的专职抗原呈递细胞(Antigen presenting cells，APCs)，是唯一能显著刺激初始型T细胞增殖的APCs。因而在激发机体抗病毒免疫中起着至关重要的作用。对以DCs为基础的HPV疫苗的研究发现，HPV16的某些基因片断或蛋白疫苗刺激的DCs，在体外和动物模型中均可引发特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)反应并使感染消退或产生中和抗体，提示该类疫苗有望用于预防或治疗HPV感染。然而针对常引起CA的HPV6型或11型的DC疫苗研究却很少。 浙江大学硕士学位论文 本研究以CA病损组织粗提蛋白为抗原分别与来源于外周血和脐血的单核细胞分化而来的DCS共同孵育，用流式细胞仪分析DCS表面与抗原提呈功能相关的表型分子 MHC＊（HLA－DR）和 CD86（B7．2）的变化；MTT法观察 DCS刺激同种自体和异体外周血及同种异体脐血T淋巴细胞增殖能力的改变：ELISA法观察DCS分泌细胞因子 ILIZ和 DCS刺激自体外周血淋巴细胞分泌 IFN＊水平的改变等方法来探讨CA病损组织粗提蛋白对DCs免疫功能的影响。为CA病损组织蛋白提取物或HPV6门 病毒蛋白抗原刺激的 DCS作为 CA的防治疫苗提供一些实验依据。 材料 禾 方法 脐血来自正常足月胎儿脐带血，外周血来自健康成人自愿献血者。CA病损组织取自女性CA患者皮损，包皮来自包皮过长的患儿（环切术留取）。实验试剂：①细胞因子rhGM－CSF、山几－4和IL－2；＠MTT试剂；＠单克隆抗体：CDla、CD86、＊D14、＊＊入＊＊C、＊＊54、＊＊80及＊＊入OR等单抗：④P＊R反应试剂；⑤1＊IZ…70）和IFN＊的ELISA试剂盒。实验方法：贴壁法分离外周血和脐血中的单核细胞，经rhGM－CSF、rhIL－4和LPS诱导培养12天，倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测 DCS相关表面分子的表达。将培养第 4天和第 10天的上述细胞分别用 CA病损组织粗提蛋白、包皮组织粗提蛋白和 PBS刺激，前者继续培养 8天后收集细胞，用流式细胞仪检测DCS免疫表型HLA－DR和CD86表达的变化；后者继续培养2天后收集细胞，用MTT法分析DCS刺激同种自体和异体外周血及同种异体脐血T淋巴细胞增殖能力的变化。将诱导培养第4天的上述细胞（外周血来源）分别与CA病损组织粗提蛋白、包皮组织粗提蛋白、PBS和LPS共孵育48小时，以 10＊的比例与自体外周血淋巴细胞共孵育 2天（方法 1）或以 1：20的比例与自体外周血淋巴细胞共孵育 10天（方法 2人 分别收集上清，ELISA法检测 ILl 的含量。另外上述刺激后的 4组 DCS分别以 1：20的比例与自体外周血淋巴细胞共同孵育 14天（以蛋白和自体外周血淋巴细胞每 4天重刺激一次），收集上清，ELISA法 5 浙江大学硕士学位论文测定细胞因子IFN＊的含量。 结 果 1、体外诱导培养的细胞在光学显微镜下的形态：人外周血和脐血来源的单核细胞经体外诱导培养8～10天后，细胞大部分悬浮，形态不规则且有大量突起；培养12天后的细胞大部分贴壁，突起呈树叉状向四周伸展。 2、细胞表型分析结果：外周血和脐血来源的单核细胞经体外诱导培养12天后，高表达 DCs相关分化抗原 CDlaO6％，48．3％X CD80（7．7％，75石％X CD86四．7％，89％）、HLA－ABC（gi．4％，gi．8％）、CD54（83．5％，86．2％）、及 HLA－DR（88．4％，90．8％）；低表达单核细胞相关分化抗原CD14O石4％，6．82％卜 3、CA和包皮组织中 HPV的 PCR扩增及鉴定结果：以质粒 pUC genome DNA为阳性对照，以CA组织和包皮组织中抽提的DNA为模板，PCR扩增后经凝胶电泳鉴定。可以检测到 CA病损组织样本中 263 hp大小的 HPV6b型和 144 hp大小的HPV型，而包皮组织中则未检测到 HPV 6b型或 HPV型。 4、蛋白刺激后 DCs的表型分析结果：无论是外周血来源（表 1）还是脐血来源（表2）的DCs，CA病损组织粗提蛋白刺激后的DCS均高表达表面分子CD86 （88石％，gi．7％）和 HLA－DR（85?