体外诊断(In Vitro Diagnosis,IVD)在疾病预防及诊断、疗效监测、预后观察、药筛、健康水平评价等领域发挥着重要的作用,全球范围内,约占三分之二的医疗决策是基于体外诊断信息而作出的。为了在疾病预防、诊断、治疗上提供更科学的决策依据,发展体外诊断技术、丰富体外诊断手段是一个重要方向。IVD在大型医院中心实验室已经实现高灵敏度检测及全面自动化,但是受仪器笨重昂贵、耗时长、操作人员须接受严格专业培训等限制,无法满足诸如传染病现场快速诊断、急重症疾病快速诊断等需求,也无法在基层医疗单位使用或者实现家庭自检。即时诊断(Point-of-careTesting,POCT)技术产品降低了对配套设备和操作专业性的要求,可用于传染病现场快速检测,可用于社区卫生服务站或中心、乡镇卫生院、诊所等基层医疗单位,并能让患者在家中实现自检。在实际应用中,某些项目(特别是传染病检测项目)无需定量,但往往需要较高的分析灵敏度。使用胶体金产品检测其灵敏度难以满足需求,因而迫切需要建立性能可以与中心实验室检测方法相媲美的高灵敏现场快速免疫检测方法。另一方面,临床上需要现场快速定量检测的免疫指标越来越多,而传统的胶体金产品在灵敏度、线性范围、定量准确性等方面均难以胜任。本论文致力于开发基于免疫层析的快速检测方法,以实现快速高灵敏度定性检测和快速高灵敏度定量检测。本研究第一部分主要建立了一种新型的基于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的免疫层析平台。通过区别于传统层析纸条的布局,专门设计的卡壳,并对底物系统、封闭体系等关键工艺步骤进行了研究,克服了在传统酶免试验中需要洗涤液进行洗涤、显色、终止等多个步骤的问题,最终只需两步操作,在30min内即可完成反应,提升了操作的简便性。且显色后膜背景干净,条带清晰,不会因膜背景控制不利而出现假阳性结果,便于进行结果判读。由于HRP催化底物显色后带来的级联放大效应,基于HRP标记的免疫层析试纸条灵敏度比传统胶体金标记纸条的灵敏度高40倍,同时具备良好的特异性。在该平台上分别研制了甲/乙型流感病毒抗原快速联检诊断试剂和呼吸道合胞病毒抗原快速诊断试剂,对甲型流感毒株检测的分析灵敏度可达0.00025个血凝滴度(Hemaglutinin,HA),对乙型流感毒株检测的分析灵敏度为0.01HA。评价临床拭子标本共1487例,甲型流感检测对照PCR检测总灵敏度可达77.52%(69.58%-83.87%),特异性达到99.83%(99.37%-99.95%),对鼻咽拭子标本的检出灵敏度为90.16%(80.15%-95.41%),特异性为 99.65%(98.73%-99.90%),对口咽拭子的检出能力相对鼻咽拭子的检出则有一定差距,对口咽拭子的检出灵敏度为66.18%(54.34%-76.29%),特异性为 100%(99.34%-100.00%)。乙型流感检测对照参考试剂的总检出灵敏度为71.17%(63.79%-77.57%),其中鼻咽拭子标本的检出灵敏度为 82.56%(73.20%-89.14%),特异性为 100%(98.70%-100.00%),对口咽拭子标本的检出灵敏度为58.44%(47.29%-68.79%),特异性为99.68%(98.84%-99.91%)。RSV酶免纸条经过了 1078份临床标本评价,对鼻咽抽吸液检测与对照试剂符合率达到96.03%(94.34%-97.32%),对鼻咽拭子检测的符合率为90.52%(86.94%-93.38%),对总共1078份标本的检测总符合率为94.25%(92.69%-95.56%),kappa 值为 0.86(一致性最强)。研究第二部分建立了一种基于时间分辨荧光微球标记的高灵敏度免疫层析定量检测平台,确定了以碳化二亚胺活化方法进行微球和蛋白间共价偶联。研制出了配套荧光纸条的基于线扫描的光纤版扫描式荧光读值仪,确定了以检测线下面积与质控线下面积比值作为原始定量值,读值仪对同一纸条的读值CV不超过3%。研制出了 CRP和PCT定量检测试纸条,CRP可定量范围为1mg/L-100mg/L,PCT可定量范围为100pg/mL-10ng/mL,两者均覆盖了具有临床意义的区间,与具有明确临床背景的标本进行相关性分析,相关系数R2分别为0.9934和0.9204。研制出了 TB-IGRA定量试纸条,可定量范围为12.5 pg/mL-400 pg/mL,与商品化ELISA一致,选取29份标本进行两者间的相关性分析,R2为0.9373,1113份临床标本评价与对照试剂总符合率达93.87%(92.30%-95.14%)。基于双抗原夹心法研制出了 HCV定性检测试纸条,分析灵敏度比商品化夹心法ELISA高3-5倍,对42份经CHIRON RIBA确证为抗HCV阳性的来自临检中心的标本进行检测,HCV抗体检测试纸的灵敏度为47.62%(33.36%-62.28%),高于罗氏和北京万泰夹心法和间接法 ELISA 试剂的 21.43%(11.71%-35.94%),19.05%(9.98%-33.30%),19.05%(9.98%-33.30%)。综上,本研究成功开发出一个高灵敏度、定性免疫检测平台和一个高灵敏度、定量检测平台,并分别基于平台开发出多种临床上迫切需求的的快速诊断试剂,在临床上具备广阔的应用前景。