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猪肝羧酸酯酶(pig liver carboxylesterase,PLE)在猪的肝脏中丰度高,属于丝氨酸水解酶,是哺乳动物同类酶中最复杂的酶家族,PLE各同工酶之间基因序列高度同源。本研究团队从通城猪和大白猪体内已克隆到108种PLE亚型,除去5种已报道亚型,发现103种新亚型,根据5个变异区25个位点的氨基酸类型,将103种新亚型重新分为7大类(A～G),内用阿拉伯数字区分。发现其中的两个主要亚型PLE-A1和PLE-B9可以高活力水解抑炎介质大麻素(2-AG),产生花生四烯酸(AA)从而上调炎症水平。在前期研究基础上,进一步锁定在大白猪和通城猪炎症反应中发挥作用的PLE主要亚型是本论文研究的目标。具体方法和主要结果如下:选取大白猪和通城猪PLE同工酶中丰度较高的12个亚型进行研究,依次为PLE-A1、PLE-B9、PLE-C1、PLE-C4、PLE-D1、PLE-E4、PLE-F1、PLE-F4、PLEG3、PLE-G5、PLE-G14、PLE-G16(涵盖A-G各类)。首先构建PLE 12个亚型的真核过表达质粒(PLE-A1、PLE-B9课题组前期已构建),并设计合成si RNA,通过WB试验筛选出一对高效沉默PLE所有亚型的通用型si RNA;在细胞炎症模型(293T+PAM)中过表达与和沉默PLE各个亚型,检测促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平,发现12个亚型提升促炎因子水平的效果各不相同,提示PLE不同亚型水解大麻素能力不同,为下一步研究通城猪与大白猪调控炎症反应主要PLE亚型奠定了基础。其次构建PLE 12个亚型的原核表达质粒(PLE-A1、PLE-B9课题组前期已构建),纯化原核表达产物后得到12种亚型重组蛋白,通过对其水解通用底物pNPA活性的测定,证明获得的重组蛋白均有酶活性,且不同亚型对通用底物水解活力不同。LC-MS/MS检测12个PLE亚型体外水解大麻素(2-AG和AEA)的比活,发现不同亚型体外水解大麻素的能力差异很大。最后在LPS诱导的猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)炎症模型上,分别添加各种亚型重组酶,检测促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12等)m RNA水平和蛋白水平,结果表明PLE水平与促炎因子(m RNA和蛋白质)水平正相关,且不同亚型促炎因子水平与其水解大麻素活力正相关。通城猪和大白猪不同年龄段的PLE亚型和丰度不同,所以将蛋白质芯片结果与大白猪和通城猪PLE表达谱相结合,从而确定了在通城猪和大白猪不同年龄段起关键作用的主要亚型。最终确定大白猪炎症中起作用的主要亚型为PLEA1、PLE-B9、PLE-G5,通城猪炎症反应中起作用的主要亚型为PLE-B9、PLE-C4、PLE-G3、PLE-G5。