漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶。它对芳香族化合物、甾体激素和生物色素等具有广泛的催化特异性。统计发现,它可以催化氧化大约三百余种不同类型的底物,在家具装饰、低污染纺织、纸张脱色、生活洗涤和食品饮料等一系列行业中都具有巨大的应用潜力。近年来,对漆酶的研究日益受到重视。漆酶的来源非常广泛,大致可分为植物漆酶、昆虫漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。其中,细菌漆酶相对于其他漆酶,具有来源广、生长周期短、热稳定性好、pH范围宽等优势。而大肠杆菌(Escherichia coli)漆酶作为一种重要的细菌漆酶,针对其研究的文献报道也越来越多。虽然已有部分文献对E.coli漆酶进行过相关研究,但针对其自身信号肽、前导肽以及第三结构域对其功能的影响却未见报道;虽然针对E.coli漆酶和真菌漆酶结构差异部分的研究已有相关报道,但差异部分对其功能的影响却始终不明确。本研究以E.coli来源的漆酶CueO作为研究对象,首先实现了其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的异源表达,并研究了表达产物的酶学特性。为阐明CueO自身信号肽、前导肽、第三结构域以及不同结构域间连接区段特有的“盖子”结构对其功能的影响,本研究通过部分缺失或替换等手段构建了相关的突变体,并对突变体表达产物进行了分析。为进一步提高突变基因的表达量,本研究参照P.pastoris密码子偏好性对突变基因进行了优化,并实现其异源高效表达。本研究的主要结果为:(1)克隆得到E.coli漆酶CueO,并在P.pastoris中实现胞外分泌表达。其最适底物为ABTS,最适反应pH为3.0,最适反应温度为45℃,最适反应时间为10 min,最适Cu2+离子为2.0 mM。在摇瓶发酵甲醇诱导72 h后,蛋白表达量最高为81.26 μg/mL,酶活最高为356.67 U/L。在常见的7种金属离子中,除了Mn2+离子对酶活没有影响,其他金属离子均会抑制CueO酶活。(2)通过对一系列的缺失突变体的研究,发现信号肽的缺失(CueO-△Sp)分别将CueO的蛋白表达量和酶活提高为250.29 μg/mL和1248.36 U/L,是野生型CueO的3.08倍和3.5倍;结构域间连接区段的缺失虽然提高了蛋白表达量,但导致CueO失活;前导肽的缺失阻碍了蛋白的分泌;无论对CueO结构域之间连接区段中的a-螺旋进行缺失或者替换,均会导致CueO的彻底失活。(3)通过参照P.pastoris密码子偏好性将去除信号肽的突变体CueO-△Sp进行优化,得到了 2条优化基因,并导入P.pastoris中实现异源表达。优化后基因的蛋白表达量和酶活均比优化前的突变体要高,且最高的蛋白表达量为450.19μg/mL,最高的酶活为2880.69 U/L,是优化前CueO-△Sp的1.8倍和2.3倍,是野生型CueO的5.54倍和8.07倍。