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本研究从广西巴马香猪腹部皮下获取脂肪组织,并用胶原酶消化法分离得到巴马香猪脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs);从巴马香猪腿骨分离得到了骨髓间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs);从巴马香猪耳源组织培养得到了耳源成纤维细胞(PigEar Fibroblasts,PEFs),观察它们原代和传代后的细胞形态。将分离得到的细胞用低糖-DMEM(Dulbecco,s modified Eagle’s medium low glucose,LG-DMEM)培养和传代,并进行生长曲线、细胞集落和核型分析来检测三种细胞的生长特性及遗传稳定性。利用免疫荧光染色检测三种细胞与多能性相关的因子(Oct4、Sox2和Nanog)的表达情况,选择适当抗体,利用流式细胞技术检测巴马香猪ASCs和BMSCs多种表面抗原的表达情况,并将巴马香猪ASCs和BMSCs体外诱导分化后进行相关基因的检测,初步探索巴马香猪ASCs和BMSCs的体外诱导分化能力。并用P5和P10巴马香猪ASCs和BMSCs作为手工克隆(handmade coloning,HMC)的供体细胞,进行核移植。利用QRT-PCR技术,在分子水平上检测与胚胎发育相关的基因(Oct4、Sox2、Nanog和DNMT1)在三种细胞的手工克隆重构胚囊胚上表达情况。初步探索巴马香猪ASCs和BMSCs作为手工克隆供体细胞能否提高核移植效率的可行性。研究结果如下。(1)分离所得的原代ASCs和BMSCs 7-9 d后细胞生长汇合达90%以上并停止生长;传代细胞呈成纤维细胞样和“漩涡”状生长,并随传代次数的增加,细胞的增长速度变慢,生长曲线呈“S”形,;P5代巴马香猪ASCs、BMSCs和PEFs的核型正常率均达到90%以上,随着传代次数的增加,它们的核型正常率均有不同程度的下降;免疫荧光结果巴马香猪ASCs和BMSCs表达Oct4、Sox2和Nanog多能性相关因子,表明巴马香猪ASCs和BMSCs具有干细胞的多潜能性。(2)利用流式细胞技术对巴马香猪ASCs和BMSCs多种表面抗原进行了检测。结果显示,巴马香猪ASCs和BMSCs均表达间充质干细胞的表面标记如CD29、CD44、CD90和CD105,而不表达造血干细胞的表面标记如CD31、CD45和HLA-DR。巴马香猪ASCs和BMSCs经诱导后可分化成为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞,组织染色呈阳性并且表达与三种细胞相关的特异性基因,说明巴马香猪ASCs和BMSCs具有多向分化的潜能。(3)对巴马香猪P5和P10代ASCs、BMSCs和PEFs三种细胞作为HMC的供体细胞构建核移植胚胎进行了分析。三组重构胚的囊胚率差异均不显著(P>0.05)。来自P5代ASCs核移植囊胚Oct4、Sox2和Nanog相对表达量均显著高于BMSCs和PEFs组,差异显著(P<0.05);DNMT1在ASCs相对表达量显著高于PEFs(P<0.05),但与BMSCs组相比,差异不显著(P>0.05);而Oct4、Sox2和DNMT1在BMSCs核移植囊胚表达水平显著高于PEFs组(P<0.05),而Nanog的表达水平在这两组中差异不显著(P>0.05)。结论:分离得到的巴马香猪ASCs和BMSCs具有多能性和多向分化的潜能;巴马香猪ASCs构建的核移植胚胎可能具有较高的发育潜能。