研究背景:组蛋白化学修饰（histone modification）,包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等,在表观遗传调控基因表达的过程中发挥了重要的作用,与DNA修复、基因转录、细胞周期、应激反应以及机体发育、分化、衰老等几乎所有生命过程密切相关。其中组蛋白甲基化是目前研究最广泛也是调控最复杂的组蛋白修饰形式之一,主要是在H3和H4组蛋白的N末端的精氨酸（R）和赖氨酸（K）残基上添加一个、两个或者三个甲基化基团,从而招募不同的调控蛋白,活化或抑制基因的转录。组蛋白上不同位点的甲基化修饰也具有不同的转录调控功能。例如,在组蛋白H3上,第4位赖氨酸（Histone 3 Lysine 4,H3K4）和第36位赖氨酸（H3K36）的甲基化可以促进基因转录活化;而第9位赖氨酸（H3K9）和第27位赖氨酸（H3K27）的甲基化则与基因抑制相关。因此,阐明不同组蛋白修饰的识别模式,有助于深入了解表观遗传修饰对靶基因的调控机制。ASH1L（Absent,small,or homeotic disc1-like）蛋白是三空腔蛋白家族（Trithorax group,Trx G）的成员。ASH1L包含多个结构域,包括AWS（associated with SET）、SET（Su（var）3-9,Enhancer-of-zeste,Trithorax）、半胱氨酸富集的post-SET、溴域（Bromodomain,BrD）、植物同源锌指结构域（plant homeodomain,PHD）、以及BAH（Bromo-adjacent homology）结构域等。由于ASH1L中保守的SET结构域具有组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性,因此ASH1L可以通过甲基化修饰组蛋白H3K4和H3K36位点,拮抗由多梳蛋白家族（Polycomb group,Pc G）所介导的基因沉默,促进基因表达。研究表明,ASH1L在哺乳动物神经系统的正常发育,肌肉萎缩的发病机制,免疫细胞分化发育等方面都发挥着重要作用。此外,ASH1L在急性白血病、甲状腺癌、前列腺癌、肾细胞癌和肝癌等多种癌症中被证实是一种促癌基因。在治疗方面,目前已经开发出了第一个针对于ASH1L SET结构域的抑制剂AS-99,并在MLL1融合的白血病细胞中表现出显著的抗白血病活性,这也表明ASH1L是潜在的癌症治疗的蛋白靶标。PHD结构域是一个由50到80个氨基酸组成的保守结构域,一般由两个反向平行的β-折叠和一个C末端的α-螺旋组成,并通过典型的C4HC3（Cys4-His-Cys3）结合模式结合两个锌离子。PHD结构域一般存在于组蛋白修饰酶、转录因子或染色体重塑复合体等染色体相关的核蛋白中,在识别组蛋白修饰以及定向招募调控蛋白方面发挥重要的作用。研究表明,PHD结构域可以选择性地结合H3组蛋白N末端上具有不同化学修饰的赖氨酸残基,如野生型无甲基修饰的H3K4（H3K4me0）、三甲基化的H3K4（H3K4me3）、H3K9me3、乙酰化的H3K14（H3K14ac）等。所以不同的蛋白可以通过PHD结构域特定的识别功能结合并锚定在不同的基因位点处,并进一步调控该位点的组蛋白修饰、基因转录或染色体重塑。然而,关于ASH1L的PHD结构域如何阅读并结合H3组蛋白上的甲基化修饰,以及PHD结构域在ASH1L的生物功能中所发挥的作用目前并不完全清楚。前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）是发生于前列腺上皮的恶性肿瘤,目前是世界第二大常见的男性恶性肿瘤,也是导致男性患者死亡的主要原因之一。虽然目前针对局部前列腺癌有手术切除、放疗等多种治疗手段,但多达40%的患者最终会复发,而复发或出现转移的晚期前列腺癌会逐渐对雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy,ADT）产生耐药性并最终发展为无法治愈的去势治疗抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC）。尽管有研究显示雄激素受体（androgen receptor,AR）的异常可能与ADT抵抗有关,但目前为止关于CRPC的具体发生机制并不完全清晰,所以针对前列腺癌尤其是CRPC的发生发展还有待进一步的研究。研究目的:探究ASH1L蛋白的PHD结构域对组蛋白H3上不同赖氨酸位点甲基化修饰的识别作用,解析PHD与H3甲基化小肽的蛋白复合体核磁共振结构并分析其识别的特点和分子机制,分析PHD结构域在ASH1L蛋白中的功能,探究ASH1L蛋白在前列腺癌发生发展中的作用机制,在表观遗传调控方面为前列腺癌提供新的治疗靶点。研究方法:（1）体外蛋白质结合亲和力分析:通过原核细胞表达系统表达、纯化ASH1L的PHD结构域蛋白质,利用peptide array实验、核磁共振-异核单量子（Nuclear Magnetic ResonanceHeteronuclear Single Quantum Coherence,NMR-HSQC）技术和等温滴定（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）实验,检测ASH1L-PHD结构域与H3组蛋白N末端上不同甲基化修饰位点的结合特异性,并通过ITC和NMR HSQC滴定实验测定其结合亲和力常数;（2）蛋白质复合体分子三维结构解析:利用多维核磁共振技术（NMR）解析ASH1L-PHD结构域与H3K4me2（1-15）小肽的蛋白复合体在溶液中的高精度分子结构,通过氨基酸点突变技术和ITC确认PHD结构域的结合口袋中的关键氨基酸残基,通过蛋白结构重叠比较ASH1L-PHD结构域与其他PHD结构域在分子结构上的异同点;（3）细胞生物学功能机制:在不同前列腺癌细胞系中,通过western blot实验检测ASH1L表达水平以及H3K36me2整体水平,分析ASH1L对细胞中H3K36me2水平的影响;构建并转染具有ASH1L活性核心的完整C末端过表达质粒（Flag-ASH1L-C）,以及PHD结构域删除的C末端过表达质粒（Flag-ASH1L-C-ΔPHD）,分析PHD结构域在ASH1L蛋白中的功能;利用小干扰RNA技术（si RNA）敲低细胞中ASH1L的m RNA水平,并借助RNA测序技术（RNA-seq）分析ASH1L在前列腺癌细胞系PC3中参与调控的下游基因和信号通路,通过qRT-PCR和western blot技术验证ASH1L调控细胞周期和细胞凋亡的分子机制;通过流式细胞术（Flow cytometry）、克隆形成实验和MTT实验在细胞水平验证ASH1L对细胞增殖、凋亡和细胞活力的影响。研究结果:（1）ASH1L-PHD结构域能识别三种不同甲基化状态的H3K4小肽（H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3）,且结合的亲和力强度相近,但未见其结合野生型的H3K4me0小肽,对组蛋白H3K9me2和H3K36me2小肽也未见明显结合;（2）解析出ASH1L-PHD结构域和H3K4me2（1-15）小肽的蛋白复合体NMR结构;（3）ASH1L-PHD结构域有一个较狭窄的结合口袋,位于结合口袋上的氨基酸残基Asp2573、Ile2575、Met2588、Trp2597以及口袋附近的Glu2585可以影响结合口袋的正确折叠,以及PHD与H3K4上不同甲基化修饰间的结合力强度和结合倾向性;（4）证明了PHD结构域在ASH1L蛋白发挥组蛋白甲基转移酶功能中的重要性,过表达ASH1L的C-末端活性核心可以提高细胞中H3K36me2水平,而PHD结构域缺失会影响ASH1L的正常功能,导致H3K36me2水平下调;（5）相对于雄激素敏感型的前列腺癌LNCa P细胞系,ASH1L在雄激素受体阴性的CRPC细胞系PC3和DU145中有更高的蛋白表达水平,敲低ASH1L能调节细胞凋亡和细胞周期相关基因的m RNA和蛋白水平,从而导致PC3和DU145细胞的细胞周期停滞、细胞凋亡,并降低细胞集落形成。研究结论:本项研究首次报道了ASH1L-PHD结构域是一个能够识别H3K4三种不同甲基化修饰且具有相似亲和力强度的阅读蛋白,表明ASH1L-PHD能非选择性地结合不同甲基化状态的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3。通过解析ASH1L-PHD与H3K4me2小肽的蛋白复合体NMR分子结构,表征K4me2侧链嵌入在PHD结合口袋中,发现ASH1L-PHD的结合口袋中狭窄的作用空间和特殊的氨基酸残基组成导致了其与甲基化K4间特异的结合强度和结合选择性。证明了PHD结构域识别H3K4甲基化是ASH1L发挥甲基转移酶功能的关键,PHD结构域缺失可使细胞中ASH1L蛋白依赖的H3K36me2水平降低。此外,相对于雄激素敏感型的前列腺癌LNCa P细胞系,ASH1L在雄激素受体阴性的CRPC细胞系PC3和DU145中有更高的蛋白表达水平,ASH1L可以通过上调CCNA1、CCND1等基因的表达促进细胞周期循环,下调caspase3等凋亡相关分子的活化抑制细胞凋亡,促进前列腺癌细胞的生长和存活,在前列腺癌细胞中发挥促癌功能。