巯基蛋白酶抑制剂是广泛存在于脊椎动物、昆虫和植物体内的一种对巯基蛋白酶活性有抑制作用的蛋白质，植物来源的巯基蛋白酶抑制剂已从单子叶植物和双子叶植物中发现了30多种。植物巯基蛋白酶抑制剂参与种子休眠和萌发过程中内源性蛋白酶活力的调节，可保护贮藏蛋白不被种子中的内源巯基蛋白酶水解。植物巯基蛋白酶抑制剂还具有抑制某些病原微生物及某些昆虫体内蛋白酶的作用，是植物体的一种自然防御体系，保护植物免受真菌和昆虫的侵袭。研究报道，将巯基蛋白酶抑制剂基因转化植物，可提高转化植株对昆虫和线虫的抗性。植物蛋白酶抑制剂作为天然的抗虫物质在植物抗逆性基因工程中受到越来越多的重视。 本文以茶树品种龙井43鲜叶为材料，根据巯基蛋白酶抑制剂的保守氨基酸序列设计简并引物，利用RT-PCR和3/5RACE技术，首次克隆出茶树巯基蛋白酶抑制剂基因(Teacystatin，简称TC)cDNA的全长序列。序列测定表明，TeacystatincDNA的全长序列为627bp，在起始密码子上游有一个由87个碱基组成的5非编码区，在终止密码子下游有一个由238个碱基组成的3非编码区，包括1个加poly(A)信号和一个长度为20个腺苷酸的poly(A)尾，开放阅读框编码101个氨基酸，分子量为11.06kDa。经Blast比对发现Teacystatin的氨基酸序列与多数植物巯基蛋白酶抑制剂的氨基酸序列具有较高的同源性，同源性为70％～87％。该基因在推测的氨基酸序列中含有巯基蛋白酶抑制剂家族中高度保守的、与其活性有关的Gly6、QXVXG(Q49V50V51S52G53)、A/PW(P79W80)结构。RT-PCR分析表明，该基因在茶树正常的不同组织中均有表达。 根据TeacystatincDNA编码区序列设计引物，以茶树鲜叶染色体基因组总DNA为模板进行PCR扩增，获得由328bp组成的TeacystatinDNA片段，序列分析表明：Teacystatin基因DNA片段内无内含子序列。Southern杂交结果表明该基因以单拷贝的形式存在于染色体基因组中。此基因的克隆，为深入研究Teacystatin基因结构、表达和调节机制及其结构和功能的关系奠定了重要的基础。 为了研究茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的功能，构建了Teacystatin的原核表达载体。通过RT-PCR法扩增出TeacystatincDNA编码区序列，将其定向克隆到表达载体pET-32a(+)上，得到重组质粒pET-TC，在表达宿主菌BL21trxB(DE3)中高效表达，产生分子量约为31.8kDa的特异融合蛋白。实验表明：随着诱导时间的延长，表达的融合蛋白Trx-TC的产量逐渐增加，特异蛋白的表达量最高可占菌体总蛋白的35.4％；在15℃、25℃、30℃和37℃四个不同诱导温度下和IPTG终浓度在0.5～5mmol/L范围内均能诱导产生融合蛋白，表达的产物主要以可溶性蛋白形式存在。另外，体外酶促反应表明：表达的融合蛋白Trx-TC对木瓜蛋白酶有明显的抑制活性，说明茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的表达产物能抑制活性中心含半胱氨酸残基的蛋白酶的水解作用，因而具有正常的生物学功能。且表达产物经100℃高温处理20min后，仍具有生物活性，表现出较好的热稳定性。 为了研究Teacystatin基因在利用基因工程技术培育抗虫转基因植物中的潜在价值，成功构建了表达Teacystatin基因的植物表达载体pBI121-TC，通过农杆菌介导的叶盘转化法，将其导入烟草中，在诱导生根移栽后对转化的烟草植株进行了一系列的分子检测。PCR和SouthernBlot检测表明Teacystatin基因已整合到烟草基因组中，RT-PCR检测结果表明Teacystatin基因能在烟草体内进行正常转录。从转基因烟草植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应，对木瓜蛋白酶酶活力的抑制作用明显强于非转基因烟草，表明茶树巯基蛋白酶抑制剂基因在转基因植物中的表达产物具有正常的生物学功能，能提高植物对巯基蛋白酶活性的抑制作用。