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褐藻聚糖硫酸酯是褐藻中主要生物活性成分,研究表明低分子量褐藻聚糖硫酸酯易吸收,功效显著。研究通过筛选微生物,利用微生物酶降解褐藻聚糖硫酸酯获取低分子量的褐藻聚糖硫酸酯。
本文以大连海域产笼目海带(Kjellmaniella crassifolia)中提取的褐藻聚糖硫酸酯为唯一碳源,通过筛选海水、海沙、污水、海带根、皮口海域海泥中的微生物,以生物量、褐藻聚糖硫酸酯多糖利用率及酶活力为指标,进行褐藻聚糖硫酸酯降解酶产生菌的优选。通过分离、纯化、鉴定,获得了产酶株菌,命名为7-3,其褐藻聚糖硫酸酯利用率为22.48%,产酶酶活力为95.00U/mL;经16srDNA测序比对,鉴定菌株7-3为Formosaundariae台湾裙带菜菌属。革兰氏阴性菌。其在固体平板上生长良好,表面光滑,向上凸起,呈黄色圆形菌落。经验证菌株7-3产酶能力可稳定遗传,其代谢产生的褐藻聚糖硫酸酯酶为胞外酶。
利用单因素实验和正交实验,通过培养基配方(碳源浓度、氮源种类、氮源浓度、Nacl浓度)、培养条件(培养温度、初始pH、接种量、装液量)两个方面,对菌株产酶进行了优化,其中影响最大的因素为温度,影响最小的因素是NaCl浓度。经优化后7-3菌株酶活力可达到127.5U/mL生物量OD600nm为1.198;确定最适培养基成分为褐藻聚糖硫酸酯浓度0.2%,酵母粉浓度0.7%,NaCl浓度3%,初始pH7.0,最适培养条件为培养时间72h,温度28℃,装液量75mL,接种量20%。根据优化后的条件进行了10L发酵罐扩大产酶实验,在60h时达到最大值,此时酶活力为133.17U/mL,96h发酵过程中,发酵罐内pH值由7.34逐渐升至8.60,表明菌株生长代谢过程中有碱性物生成。
采用丙酮沉淀法对菌株7-3所产褐藻聚糖硫酸酯酶进行提取,探究确定最佳丙酮的添加量为原酶液的两倍体积。利用提取的粗酶,对褐藻聚糖硫酸酯进行酶解,酶解产物经SephacrylS-100凝胶柱洗脱获得4个分离纯化组分(F1、F2、F3、F4)。4个组分总糖含量分别为F1:76.71%、F2:56.22%、F3:43.82%、F4:69.30%,除F3外各组分总糖含量均高于50%。
利用高效液相测定了4个组分的单糖组成。经测定F1、F2、F3、F4均含有甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡糖糖、半乳糖、木糖、岩藻糖。因各组分分子量大小存在差异,各组分各单糖组成比例也不同。4个组分均以岩藻糖、葡萄糖为主;并随着分子量的减小,分离纯化组分中岩藻糖含量逐渐降低,葡萄糖含量逐渐增加。
红外光谱结构分析表明各组分在3376~3507cm-1附近均有O-H伸缩振动,是糖共有类特征吸收峰;在2940~3932cm-1附近均有岩藻糖甲基吸收峰;在1620~1631cm-1附近均含有C=O非对称及对称伸缩振动吸收峰,证明均含有糖醛酸,与单糖组成的测定结果一致;各组分均含有硫酸基团,4个组分在C2或C3位置均链接有硫酸根基团,F2、F3、F4组分在C4位置也链接有硫酸基团,而F1组分在C4位置没有硫酸基团。
本文以大连海域产笼目海带(Kjellmaniella crassifolia)中提取的褐藻聚糖硫酸酯为唯一碳源,通过筛选海水、海沙、污水、海带根、皮口海域海泥中的微生物,以生物量、褐藻聚糖硫酸酯多糖利用率及酶活力为指标,进行褐藻聚糖硫酸酯降解酶产生菌的优选。通过分离、纯化、鉴定,获得了产酶株菌,命名为7-3,其褐藻聚糖硫酸酯利用率为22.48%,产酶酶活力为95.00U/mL;经16srDNA测序比对,鉴定菌株7-3为Formosaundariae台湾裙带菜菌属。革兰氏阴性菌。其在固体平板上生长良好,表面光滑,向上凸起,呈黄色圆形菌落。经验证菌株7-3产酶能力可稳定遗传,其代谢产生的褐藻聚糖硫酸酯酶为胞外酶。
利用单因素实验和正交实验,通过培养基配方(碳源浓度、氮源种类、氮源浓度、Nacl浓度)、培养条件(培养温度、初始pH、接种量、装液量)两个方面,对菌株产酶进行了优化,其中影响最大的因素为温度,影响最小的因素是NaCl浓度。经优化后7-3菌株酶活力可达到127.5U/mL生物量OD600nm为1.198;确定最适培养基成分为褐藻聚糖硫酸酯浓度0.2%,酵母粉浓度0.7%,NaCl浓度3%,初始pH7.0,最适培养条件为培养时间72h,温度28℃,装液量75mL,接种量20%。根据优化后的条件进行了10L发酵罐扩大产酶实验,在60h时达到最大值,此时酶活力为133.17U/mL,96h发酵过程中,发酵罐内pH值由7.34逐渐升至8.60,表明菌株生长代谢过程中有碱性物生成。
采用丙酮沉淀法对菌株7-3所产褐藻聚糖硫酸酯酶进行提取,探究确定最佳丙酮的添加量为原酶液的两倍体积。利用提取的粗酶,对褐藻聚糖硫酸酯进行酶解,酶解产物经SephacrylS-100凝胶柱洗脱获得4个分离纯化组分(F1、F2、F3、F4)。4个组分总糖含量分别为F1:76.71%、F2:56.22%、F3:43.82%、F4:69.30%,除F3外各组分总糖含量均高于50%。
利用高效液相测定了4个组分的单糖组成。经测定F1、F2、F3、F4均含有甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡糖糖、半乳糖、木糖、岩藻糖。因各组分分子量大小存在差异,各组分各单糖组成比例也不同。4个组分均以岩藻糖、葡萄糖为主;并随着分子量的减小,分离纯化组分中岩藻糖含量逐渐降低,葡萄糖含量逐渐增加。
红外光谱结构分析表明各组分在3376~3507cm-1附近均有O-H伸缩振动,是糖共有类特征吸收峰;在2940~3932cm-1附近均有岩藻糖甲基吸收峰;在1620~1631cm-1附近均含有C=O非对称及对称伸缩振动吸收峰,证明均含有糖醛酸,与单糖组成的测定结果一致;各组分均含有硫酸基团,4个组分在C2或C3位置均链接有硫酸根基团,F2、F3、F4组分在C4位置也链接有硫酸基团,而F1组分在C4位置没有硫酸基团。