家蝇(Musca domestica)能在各类病原微生物滋生的恶劣环境中生存并不断繁殖,离不开其高效的先天免疫系统,研究其抗病机制对深入了解昆虫先天性免疫具有重要意义。在哺乳动物中,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)家族成员是重要的炎性细胞因子,且进化非常保守。Eiger作为无脊椎动物TNF直系同源物最早在果蝇中被发现,并被证实在免疫应答中发挥一定作用。本实验室之前报道了一种家蝇的Eiger样基因MdEiger,此基因在家蝇幼虫受到细菌刺激后显著上调,并能协同Toll和IMD信号通路共同调控抗菌肽基因的表达和酚氧化物酶原的激活。本文基于上述的研究工作,对MdEiger在多种胁迫条件下的表达变化和组织定位进行了研究,研究结果如下:1.利用原核表达系统对MdEiger的TNF同源结构域部分进行了重组表达,并以重组产物rMdEiger为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备并获得4株抗rMdEiger单克隆抗体:2D9、2G8、3F4和4F6,抗体纯度、特异性和效价均符合Western Blot和免疫组化要求。2.Western Blot检测结果显示,细胞膜上检测到两条特异性条带:mMdEiger1和mMdEiger2;在家蝇血淋巴中存在可溶性MdEiger:sMdEiger1和sMdEiger2,其可能是酶切产物糖基化修饰的结果,且其在血淋巴中的含量会随环境的变化而发生变化。3.在大肠杆菌刺激、紫外线照射、氯化镉和阿霉素暴露条件下,通过qRT-PCR和Western Blot方法对MdEiger的表达模式进行了分析,结果发现家蝇在这些胁迫环境下MdEiger均呈现显著上调表达趋势,并不同程度地触发了可溶性蛋白sMdEiger的分泌与释放,推测可溶性MdEiger可能在免疫应答、炎症反应和氧化应激方面起着关键的调控作用。4.通过免疫组化的方法对MdEiger进行表达定位分析,在脂肪细胞膜,肌细胞的肌膜和复眼的诸多部位检测到了阳性信号,其主要分布于细胞膜部位。5.利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出可溶性重组蛋白r?MdEiger。以上研究揭示了Eiger在家蝇体内的存在形式和在各种胁迫条件下的表达规律,据此推测主要存在于家蝇脂肪体细胞和神经胞的细胞膜上。当家蝇受到环境胁迫后会利用细胞基质或外膜上的蛋白酶对Eiger胞外部分进行酶切,释放含有TNF结构域的部分肽段(sMdEiger)到血淋巴中,并通过血淋巴循环作为细胞因子调控家蝇的应激反应。该研究可为后续MdEiger的功能研究奠定基础,为揭示TNF家族的分子进化与功能多样性提供了重要依据。