犬流感病毒（Canine influenza virus,CIV）属于正黏病毒科甲型流感病毒属,能感染犬引发犬流感,出现轻度咳嗽、流涕等轻度症状,以及高烧、呼吸急促、脓性鼻涕、厌食、抑郁和出血性肺炎等重度症状。目前,流行病学研究证实马源H3N8和禽源H3N2亚型犬流感病毒能够在犬类中稳定传播,流感病毒成功的实现由马到犬、由禽到犬的跨种间传播,犬逐渐成为流感病毒进化和繁衍的“温床”。犬作为人类的伴侣动物,在现代人类生活中具有特殊的地位,犬作为流感病毒的中间宿主存在着将病毒传染给人类的潜在风险,将给人类健康带来巨大的威胁。由于流感病毒易发生抗原漂移和抗原转移,针对病毒表面抗原的中和抗体及疫苗需要不断更新,疫苗的时效性存在很大的问题,因此通用型犬流感病毒抗体药物的研究迫在眉睫。本研究以流感病毒高度保守的M1蛋白为靶标,通过噬菌体抗体库筛选特异性抗M1蛋白的scFv,并对scFv进行免疫结合活性和生物学活性研究;然后将利用具有高效跨膜转导功能的TAT蛋白构建TAT-scFv穿梭胞内抗体,在细胞水平和SPF鸡胚中评价胞内抗体对A/Canine/Guangdong/05/2011（H3N2）、A/Duck/Guangdong/W12/2011（H3N2）和A/Beijing/1/1968（H3N2）三株异源流感病毒增殖的影响。1.H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定为制备犬流感病毒（H3N2）M1蛋白纯品,针对H3N2犬流感病毒M1蛋白高度保守序列设计引物,PCR扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21（DE3）,诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,Western blot检测纯化的M1蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771bp的M1基因,成功构建pET-SUMO-M1表达质粒,经酶切纯化后获得M1蛋白纯品,为进一步制备通用型抗H3N2犬流感病毒抗体提供纯品抗原。2.抗H3N2犬流感病毒M1蛋白scFv的筛选及活性研究以M1为靶蛋白,采用固定相筛选法同时从噬菌体抗体库Tomlinson I库（库容量:1.47×10⁸）和Tomlinson J库（库容量:1.37×10⁸）中筛选抗M1蛋白的单链抗体,进行四轮生物淘洗后,显示每增加一轮筛选高亲和力阳性噬菌体克隆富集倍数都有所提高。通过间接ELISA法和PCR鉴定筛选阳性菌株,最终获得C2菌株与M1靶蛋白的免疫结合活性最显著,对C2菌株抗体基因进行分析,具有完整的单链抗体结构。C2菌株扩大培养并成功纯化出H3N2-scFv纯品,BCA检测蛋白浓度为1.6mg/mL,薄层扫描显示纯度为98.9%,利用WB法对纯化的scFv进行鉴定,结果显示制备的scFv和M1靶蛋白具有良好的免疫结合活性。在细胞水平和SPF鸡胚模型中生物学活性研究显示,scFv在浓度高达1.6mg/mL对细胞和鸡胚没有显著的毒性作用,对A/Canine/Guangdong/05/2011（H3N2）株犬流感病毒复制具有显著的抑制作用,呈现剂量依赖性特征,细胞水平IC₅₀=0.290mg/mL,鸡胚水平IC₅₀=0.120mg/mL,证明在鸡胚中,scFv的灵敏度更高。3.TAT-scFv重组穿梭胞内抗体的制备及活性研究以C2菌株pIT2-scFv质粒为模板,进行PCR扩增,成功获取867bp大小的scFv基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-28（a）-TAT中,构建重组表达质粒pET-28（a）-TAT-scFv,经PCR和双酶切鉴定显示插入的片段大小为867bp,证明pET-28（a）-TAT-scFv重组质粒构建成功。将重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中进行目的蛋白的诱导表达,经12%SDS-PAGE分析,32kDa大小处有条带,证明TAT-scFv重组蛋白成功表达,表达条件的优化结果显示表达菌在TB培养基中培养,0.6mmol/LIPTG条件下进行30℃诱导6h,重组蛋白表达量实现最高。表达菌进行中试发酵扩大培养后,精纯出浓度为2.0mg/mL的TAT-scFv重组蛋白,纯度为93.655%,利用WB法对纯化的TAT-scFv进行鉴定,结果显示在32kDa大小处出现特异性的免疫条带,证明成功制备TAT-scFv穿梭胞内抗体。利用间接ELISA法检测TAT-scFv和scFv与M1蛋白免疫结合活性的差异,结果显示在1:10¹:640稀释度两者都与M1蛋白具有良好的免疫结合活性,并且无显著差异,证明TAT细胞跨膜蛋白未对scFv单链抗体生物活性产生影响。用三株异源的H3N2流感病毒检测胞内抗体的活性,对三株H3N2流感病毒进行遗传进化分析,证实出三株H3N2流感病毒属于不同的进化分枝,分别属于犬类、禽类和人类。将三株异源H3N2流感病毒分别感染MDCK细胞和SPF鸡胚,研究不同浓度的TAT-scFv对流感病毒增殖的影响。毒性研究显示,TAT-scFv在浓度高达1.6mg/mL时对细胞和鸡胚没有显著的毒性,细胞存活率仍达到94.1%,鸡胚均发育正常,血管明显未出现死胚,也无其他病理变化,说明该蛋白本身对细胞和鸡胚均无毒性。生物活性研究显示,不论在MDCK细胞里还是在鸡胚中,TAT-scFv对三种H3N2流感病毒增殖都具有明显抑制作用,并且呈现量效关系。TAT-scFv对三种H3N2流感病毒增殖抑制作用大小分析:对A/Canine/Guangdong/05/2011（H3N2）和A/Duck/Guangdong/W12/2011（H3N2）抑制作用高于A/Beijing/1/1968（H3N2）,说明TAT-scFv对三种H3N2流感病毒增殖的抑制作用跟病毒进化过程中的分枝远近有关。TAT-scFv穿梭胞内抗体通过破坏H3N2流感病毒的M1基质蛋白,从而阻止流感病毒的装配及释放。通过观察鸡胚存活率完善对TAT-scFv抗病毒药物的评价,得到在8日内1.6mg/mL的TAT-scFv对分别感染100uLEID₅₀的A/Canine/Guangdong/05/2011（H3N2）和A/Duck/Guangdong/W12/2011（H3N2）的鸡胚组可以实现100%保护;对于感染100uLEID₅₀的A/Beijing/1/1968（H3N2）鸡胚组可以实现50%保护。本研究成功制备H3N2犬流感病毒M1蛋白,以M1蛋白为抗原成功筛选scFv,以TAT蛋白作为跨膜转运载体,成功制备TAT-scFv胞内抗体,研究显示TAT-scFv胞内抗体对不同种的H3N2亚型流感病毒的增殖具有抑制作用,说明TAT-scFv具备了成为通用型抗H3N2亚型流感病毒候选药物的可能。