胚胎生殖细胞(EG)是从胎儿原始生殖细胞(PGCs)分离培养出来的具有发育多潜能性的一种多潜能干细胞。传统的胚胎干细胞(ES)多从囊胚的内细胞团(ICM)获得,如小鼠ES。但对大家畜而言,很难获得充足的囊胚,ES建系也还没有成功。自从PGCs来源的小鼠EG细胞建立后,通过检测mEG的生物学特性和mES相似,使人们有理由相信,由其他物种的PGCs也同样能够获得EG细胞。虽然关于猪EG细胞的获得早有报道,但是,至今仍然未能建成与小鼠ES和EG一样稳定的细胞系。原因是多方面的,一是我们对猪PGCs的发生、增殖、迁移等过程缺少了解；二是我们对猪PGCs的表观遗传学变化研究甚少;三是PGCs细胞体外培养体系仍有待完善。本研究选择猪胚胎发育22天至30天的生殖嵴为研究对象,通过组织切片技术对生殖嵴形态及PGCs在体内的迁移进行了跟踪；利用Realtime PCR及亚硫酸氢盐测序技术对印记基因的表达及甲基化水平进行了分析；通过对不同胎龄、不同饲养层、不同的传代方法的比较对类EG细胞的培养条件进行了优化,期望在认知猪PGCs体内生物学变化规律的基础上优化体外培养条件,最终获得稳定传代的猪EG细胞系。主要研究结果如下：(1)组织切片HE染色法跟踪了猪生殖嵴形态变化。在胚胎发育的22天还没有形成生殖嵴；24天,中肾内侧壁局部增厚；26天,已经能够看到明显的两条细长的索状结构出现；28天,中肾内侧壁继续增厚,生殖嵴变大,凸向体腔；30天,生殖嵴发育形成可以独立分离的结构,凸向体腔。(2)Oct、Stella及Fragilis三个生殖细胞特异标记物对PGCs进行了体内跟踪。胚龄22天,生殖嵴及附近没有观察到PGCs;24天,尽管中肾内侧壁增厚,但是也未发现PGCs;26天,可见少量PGCs进入生殖嵴,但是大部分PGCs还在生殖嵴附近的肠系膜处；28天,PGCs大部分已经进入到生殖嵴；胚胎发育第30天时,PGCs几乎全部进入生殖嵴而且有聚集的趋势。(3)通过Realtime PCR的方法,分析了印记基因Igf2、H19、Xis、Peg3、Grb10、Diras3及Plagll在PGCs中的表达,结果显示,Igf2、H19及Diras3基因在22及24天的表达量明显低于26天,Grb10在28天的表达量达到最高。雌性PGCs中Xist基因在30天时表达量明显升高。(4)采用亚硫酸氢盐测序的方法,分析了22-30天PGCs中Igf2和H19两个印记基因的甲基化情况。实验结果显示,在26天前二者DMR的甲基化呈逐渐降低的趋势,26天达到最低：之后,甲基化水平逐渐升高。Igf2和H19两个印记基因在体外培养的类EG细胞中呈高甲基化状态。(5)本研究分离了不同阶段的PGCs进行体外培养,从胚胎发育24-28天的PGCs得到了类EG细胞,而在22和30天的胚胎中我们并没有观察到明显的克隆形成。比较24、26和28天的细胞克隆数及传代能力,26天的PGCs用于类EG培养具有优势。(6)本研究通过比较小鼠成纤维细胞、猪胎儿成纤维细胞及猪性腺-中肾区基质细胞共培养的方法,在原代培养中,性腺-中肾区基质细胞的培养效果要好于其它两种,而在传代培养中,三者的差异并不显著。最终采用与猪性腺-中肾区基质细胞共培养的方法得到了类EG细胞,但所得的类EG细胞在体外最高传至12代,并未建立稳定的能够体外长期传代的猪EG细胞系,说明我们的培养条件还是不够理想,仍需继续优化。(7)Realtime PCR及免疫荧光检测证明猪类EG细胞表达多能性基因Oct4、Sox2及Nanog;免疫荧光检测证明其表达胚胎阶段特异性抗原SSEA3和SSEA4; TRAP-PCR检测表明猪类EG细胞具有端粒酶活性;Realtime PCR检测证明EG细胞有Xist基因的表达。(8)本研究通过EG细胞延迟传代自发分化得到了具有上皮样、成纤维样及神经样的细胞；通过EG细胞体外悬浮培养形成拟胚体,贴壁培养后能够分化成具有三个不同胚层来源细胞特征的细胞,显示得到的类EG细胞具有多向分化潜能。(9)本研究通过EG细胞体外定向诱导分化,得到了具有向成骨细胞、成脂细胞及神经细胞分化的细胞,进一步说明了猪EG细胞的多向分化潜能。总之,本研究从妊娠24～26天猪的PGCs获得了具有一定传代能力的猪EG细胞,并且证实了猪EG体外具有体外多向分化潜能。