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卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor,VgR)属于低密度脂蛋白受体家族,主要功能是介导内吞卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)进入发育的卵母细胞,为胚胎发育提供营养物质。保幼激素(Juvenile hormone,JH)及其受体(Methoprene-tolerant,Met)除调控昆虫发育变态外,在昆虫生殖过程也具有重要作用,但其机制研究主要局限于模式昆虫。本文克隆了二化螟Chilo suppressalis CsVgR、CsMet1与CsMet2全长cDNAs,并对其分子结构特征、系统发生关系及时空表达模式进行了分析,进一步利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术系统研究了 CsVgR在二化螟生殖过程中的作用及CsMets对CsVg和CsVgR的转录调控,同时,研究了亚致死浓度氯虫苯甲酰胺对CsVgR和CsMets基因表达的影响。研究结果对进一步认识保幼激素信号通路调控昆虫生殖的分子机制和利用RNAi技术防治害虫具有重要的科学意义和应用价值。利用RT-PCR和RACE技术克隆了 6,117 bp CsVgR全长cDNA,其中开放阅读框(ORF)长5,484 bp,编码1,827个氨基酸(aa),预测蛋白质分子量(Mw)和等电点(pI)分别为203.4 kDa和5.02。结构域分析显示,CsVgR包含2个配体结合结构域(LBDs),其中第一个 LBD(LBDI)具有 4 个 Class A(LDLRA)重复,LBDⅡ具有7个LDLRA重复,而大多数非鳞翅目昆虫在LBDI和LBDⅡ中分别有5个和8个LDLRA重复。序列比对分析显示,CsVgR与甜菜夜蛾Se VgR、意大利蜜蜂AmVgR、马德拉蜚蠊Lm VgR、褐飞虱NlVgR同源基因的氨基酸序列一致性分别为52.15%、27.13%、26.97%和24.79%。此外,表达模式分析发现,CsVgR mRNA在预蛹(PP)与1日龄的雌蛹(1P)中几乎检测不到,在3日龄的雌蛹(3P)中开始表达,在刚羽化雌成虫中表达水平急剧升高,在羽化后48 h雌成虫(48hA)达到峰值。此外,与大多数昆虫VgRs类似,CsVgR在卵巢特异性表达。这些结果表明CsVgR与二化螟生殖密切相关。利用RNAi技术研究了CsVgR在二化螟生殖过程的作用。对6日龄的雌蛹注射dsCsVgR发现,与对照(dsEGFP处理)相比,dsCsVgR处理组CsVgR mRNA表达水平在羽化后48 h和72 h分别下调45.73%和65.92%。对照组羽化后72 h雌蛾的卵巢明显发育成熟,富集了大量卵子,每只雌蛾的产卵量为72.2±23.40粒,而dsCsVgR处理组雌蛾卵巢的卵子数较少,产卵量显著减少,为27.6±12.28粒/雌。这些结果表明CsVgR对二化螟的卵巢发育和生殖起重要作用。利用 RT-PCR 和 RACE 技术克隆了 2,673 bp 和 2,824 bp CsMet2 全长cDNAs,ORF分别为1,587 bp和2,598 bp,编码528和865个aa,预测Mw分别为60.34和97.37 kDa,pI分别为8.35和6.68。结构域分析显示,CsMet1和CsMet2都具有保守的 bHLH(basic Helix-Loop-Helix),PAS(Per-Arnt-Sim,PAS-A,PAS-B)和PAC(PAS C terminal)结构域。序列分析发现,CsMet1与家蚕BmMet1、BmMet2、黑腹果蝇DmMet和赤拟谷盗TcMet同源基因的氨基酸序列一致性分别为60.98%、21.88%、27.49%和 28.30%:CsMet2 与BmMet1、BmMet2、DmMet和TcMet同源基因的一致性分别为20.55%、44.19%、17.19%和22.90%;CsMet1与CsMet2氨基酸序列一致性为21.71%。CsMet1在幼虫期(3L-6L)表达量相对稳定,在预蛹期(PP)表达显著降低并在蛹期(1P-5P)维持低水平表达,在成虫期羽化后12 h雌蛾表达水平达到峰值。CsMet2表达在幼虫期(4L-5L)表达量较低,从6龄幼虫(6L)至5日龄的雌蛹(5P)表达量呈上升趋势,成虫期在羽化后48 h表达水平达峰值。组织表达模式分析表明,CsMet1在幼虫的头、血淋巴和中肠表达水平较高,CsMet2在血淋巴中表达量最高,其次是头和马氏管。进一步研究发现,CsMet1在保幼激素类似物Methoprene 处理后 1 h(2.74 倍)、6 h(2.41 倍)和 12 h(1.63 倍)均显著上调,CsMet2在Methoprene处理后1 h、6 h和12 h分别上调1.95倍、1.45倍和3.68倍,表明CsMet1与CsMet2受JH正调控。利用RNAi技术研究了 CsMet1与CsMet2对CsVg和CsVgR的调控作用。选取6日龄的雌蛹和刚羽化的雌蛾2个时间点,连续注射dsCsMet1或dsCsMet2。结果显示,沉默CsMet1或CsMet2使CsVg与CsVgR mRNA转录水平均下调,与对照相比,敲减CsMet1或CsMet2雌蛾的成熟卵子数较少。这些结果初步揭示了 JH信号通路调控二化螟生殖的潜在机制。利用饲料混毒法研究了亚致死浓度氯虫苯甲酰胺对CsVgR以及CsMet1与CsMet2 mRNA表达水平的影响,结果显示,CsVgR在LC10和LC30氯虫苯甲酰胺处理组羽化后24 h雌虫中的表达水平分别下调41.65%(LC10)和35.82%(LC30),CsMet1在LC10氯虫苯甲酰胺处理组羽化后24 h雌虫表达量是对照组的1.52倍,CsMet2在LC30氯虫苯甲酰胺处理组羽化后24 h雌虫表达下调54.62%。这些结果表明,亚致死浓度氯虫苯甲酰胺对二化螟的生殖和发育具有一定的影响。