研究背景和目的:　　 小电导Ca2+激活K+通道(Small-conductance calcium-activated potassiumchannal)有四种不同的亚型,分别是SK1、SK2、SK3和SK4通道。其中SK2主要存在于中枢神经系统,例如海马CA1锥体细胞,外周组织也有表达,例如人和小鼠的心肌、平滑肌组织。SK2是唯有通过细胞内Ca2+激活的K+通道,其钙源主要来自L-型Ca2+通道,部分来自肌浆网ryanodine receptors(RyRs)的Ca2+释放通道。研究证明,SK2对蜂毒明肽(apamin)比较敏感,它参与了动作电位的后复极化(after hyperpolarization,AHP)的形成,对调节突触后电位的形成长时程增强(long-term potentiation,LTP)的阈值以及突触的可塑性有重要意义,对于中枢神经系统的学习和记忆方面也起到一定的作用。　　 受体RyRs是存在于真核生物细胞肌浆网(Sarcoplasm icreticμlum,SR)上的一种细胞内Ca2+释放通道,现在哺乳类动物的组织中已鉴定出RyR的3种亚型,分别是RyR1(ryanodine receptor type1),RyR2(ryanodine receptor type2)和RyR3(ryanodine receptor type3)。RyR2主要存在于心肌细胞,位于细胞的肌浆网上。RyR是细胞内Ca2+释放的通道,通过释放SR内的Ca2+来调节细胞内的Ca2+浓度。主要作用机制是钙离子诱导的钙离子释放(Ca2+induced Ca2+release,CICR),为骨骼肌和心肌收缩提供肌质网Ca2+。直接参与心肌的兴奋-收缩耦联过程,RyR2的激活可使细胞内钙离子迅速增加,其Ca2+浓度可快速增高10倍以上。　　 上述提示,RyR2的激活可使大量的Ca2+从肌浆网释放出来即Ca2+诱导Ca2+释放(CICR),而SK2又是Ca2+依赖型的钾通道,其激活依赖细胞内Ca2+浓度的增高,另SK2和RyR2功能异常均可引起心肌功能的变化,如心率失常等。由此推测,SK2和RyR2在心肌中可能存在着一定的功能联系。本实验室的研究已表明心肌SK2通道与RyR2可形成免疫复合物,但是否存在直接相互作用,尚不明了。故本研究采用酵母双杂交的方法进一步检测两者之间是否存在分子相互作用的位点。对于深入研究两蛋白的结构和功能的相关性将有积极作用,并为揭示两者与心脏功能的关系探索一条新的途径。　　 方法：　　 1.目的基因扩增:构建SK2和RyR2的cDNA文库,根据文库质粒基因序列和载体质粒特点设计并合成引物。PCR扩增SK2和RyR2目的基因片段,琼脂糖凝胶鉴定并回收。　　 2.SK2-T和RyR2-T克隆构建:SK2的目的基因与T载体连接,选择培养基培养,PCR鉴定,提取SK2-T重组质粒。经双酶切SK2-T重组质粒,琼脂糖凝胶鉴定,回收目的基因片段,测序鉴定。重组RyR2-T质粒构建同SK2-T。　　 3.pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2重组质粒的构建:SK2-T双酶切纯化的目的基因插入双酶切纯化的pGBKT7载体质粒,构建重组pGBKT7-SK2质粒。选择培养基培养,PCR鉴定,提取pGBKT7-SK2重组质粒,双酶切pGBKT7-SK2重组质粒,琼脂糖凝胶鉴定,回收目的基因片段、测序鉴定。重组pGADT7-RyR2质粒构建同pGBKT7-SK2。　　 4.转化酵母菌:pGBKT7-SK2、pGADT7-RyR2电转化酵母菌。酵母菌AH109用YPDA培养基30℃恒温培养。用电转化方法将pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2重组质粒分别转化酵母菌AH109,营养缺陷培养基培养,用双营养缺陷培养基做自身激活检测；将pGBKT7-SK2的3个重组质粒分别与pGADT7-RyR2的16个重组质粒两两配对,共转化酵母菌AH109。根据酵母菌有无生长和蓝白显色鉴定双杂交结果。　　 结果：　　 1.PCR扩增3个SK2目的基因片段和16个RyR2目的基因片段,凝胶电泳可见相应大小bp处有明亮条带,与预期设计相符。　　 2.成功构建了含目的基因片段的SK2-T和RyR2-T重组质粒。　　 3.成功构建了pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2重组质粒,SK2目的基因与pGBKT7载体连接、RyR2与pGADT7连接。经双酶切及测序鉴定重组质粒,证明重组质粒构建正确。　　 4.3个pGBKT7-SK2和16个pGADT7-RyR2重组子分别转化酵母菌AH109,经鉴定pGBKT7-SK2与pGADT7-RyR2可转入酵母菌AH109,且无自身激活。　　 5.pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2共转化酵母菌AH109,无阳性蓝色菌落生长,提示SK2蛋白与RyR2蛋白片段间无直接相互作用。　　 小结:　　 1.扩增出3个SK2目的基因片段和16个RyR2目的基因片段,并成功构建了pGBKT7-SK2、pGADT7-RyR2重组质粒。　　 2.重组质粒共转化酵母菌,结果表明SK2蛋白和RyR2蛋白片段间无直接分子相互作用位点,其相互作用需经进一步的实验证实。