研究背景母胎免疫耐受作为传统免疫学的唯一例外,长期以来一直是免疫学研究的焦点和难点。正常生理妊娠时,携带半数父系遗传物质的胚胎并未引起母体的免疫排斥反应,在此过程中母-胎界面来自胎儿的滋养细胞与来自母体的免疫细胞建立的免疫耐受平衡发挥了重要作用。因此,探究母-胎界面免疫耐受形成的原因与机制以及这种耐受失调导致的妊娠相关疾病的发生具有重要的临床意义。妊娠时期母-胎界面主要由三种细胞构成:胚胎来源的滋养细胞、母体来源的蜕膜免疫细胞（decidual immune cell,DIC）和蜕膜基质细胞（decidual stromal cell,DSC）。滋养细胞功能的维持在成功妊娠中发挥着重要作用。来自胎儿的滋养细胞通过增殖与分化形成合体滋养细胞与细胞滋养细胞,合体滋养细胞又可以形成绒毛外滋养细胞,绒毛外滋养细胞可以通过增殖形成细胞柱,也可以迁移并植入母体的子宫内膜中,使胎儿与母体之间建立紧密的联系,因此,滋养细胞的增殖、侵袭与迁移能力是保证正常妊娠的关键。一旦滋养细胞的功能受损,或者母-胎界面免疫耐受微环境被打破,都可能导致母体免疫系统对胎儿的排斥和流产的发生。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）近年来逐渐走入人们的视野,尤其在肿瘤的发生发展中被认为是重要的调节因子,可以在转录以及转录后水平对蛋白与基因的表达进行调节。lncRNA在生殖相关疾病中的作用也开始受到关注。但迄今为止,lncRNA在母-胎界面免疫耐受平衡的建立与维持及复发性流产疾病中的研究仍然匮乏。本课题组在研究中发现正常妊娠者蜕膜巨噬细胞以M2为主,而复发性流产患者蜕膜巨噬细胞M2比例则显著下调,这提示M2型蜕膜巨噬细胞在维持正常妊娠的过程中可能发挥着重要作用。我们在本研究中深入探讨了复发性流产患者蜕膜巨噬细胞M2减少的原因以及母-胎界面诱导M2极化、建立局部耐受的分子机制。本研究发现,由胎儿滋养细胞分泌的外泌体可在体外诱导巨噬细胞发生M2极化。通过外泌体芯片检测分析,我们进一步发现lncRNAZEB2-AS1可在正常妊娠者滋养细胞外泌体中富集,并通过外泌体的介导进入蜕膜巨噬细胞,诱导巨噬细胞向M2极化,从而在建立和维持母-胎界面免疫耐受微环境中发挥重要作用。另一方面,我们也通过外泌体芯片和流产绒毛组织证实复发性流产患者的滋养细胞外泌体中lncRNALINC01088表达上调,且LINC01088的表达异常可显著影响滋养细胞自身的增殖、侵袭、迁移等与胚胎发育相关的生物学功能,并最终导致流产的发生。本研究深入分析了滋养细胞外泌体lncRNA在维持滋养细胞自身生物学功能和建立母-胎界面免疫耐受平衡的过程中发挥的重要作用及其关键调控机制;从维持正常妊娠到导致复发性流产,多方面地探讨了 lncRNA在母-胎界面中的角色扮演,为复发性流产的早期预警与治疗提供了新的方向与策略。目的:正常妊娠的维持离不开母-胎界面免疫耐受的建立。在妊娠期间,来自母体与胎儿的多种细胞共同参与、相互协调,形成了具有免疫耐受优势的母-胎局部微环境。一旦这种免疫耐受的优势被打破,就会导致母体免疫系统对胎儿的排斥和流产的发生。在母胎界面的多种免疫细胞中,蜕膜巨噬细胞约占全部蜕膜免疫细胞的25%。我们在研究中发现,正常妊娠者蜕膜组织中的巨噬细胞以免疫抑制型巨噬细胞（M2）为主,而复发性流产患者蜕膜中M2的数量显著减少。母胎局部是如何诱导巨噬细胞向M2极化的?M2数量减少是否是母胎耐受失衡从而导致流产的主要原因?其主要机制是什么?尚不明确。外泌体作为细胞间物质和信息传递的主要载体,可以将来源细胞的信息传递给受体细胞,从而调控受体细胞的功能,而lncRNA作为外泌体中的重要组成成分是否在此过程中发挥着重要作用?有待于进一步的研究证实。本部分研究旨在探讨滋养细胞通过其外泌体lncRNA对蜕膜巨噬细胞M2极化的调节及在建立和维持母-胎界面免疫耐受中的作用。方法:1.提取正常妊娠者与复发性流产患者蜕膜组织中CD14+单核细胞,通过荧光定量PCR方法检测蜕膜组织中M2型巨噬细胞的表达。免疫荧光方法检测蜕膜组织中M2巨噬细胞的表达情况。流式细胞术检测正常妊娠小鼠与流产小鼠蜕膜组织中M2巨噬细胞的表达情况。2.通过透射电镜、纳米粒度分析、western blotting检测滋养细胞外泌体的形态、大小、粒径分布以及表面标志的表达。3.外泌体进行荧光标记后,共聚焦显微镜观察巨噬细胞对滋养细胞外泌体的摄取情况。4.采用荧光定量PCR以及western blotting检测滋养细胞外泌体对巨噬细胞极化的影响。5.对正常妊娠者以及复发性流产患者滋养细胞来源的外泌体进行芯片检测,并在滋养细胞外泌体诱导M2极化的巨噬细胞中筛选出起关键作用的lncRNA ZEB2-AS1。设计ZEB2-AS1的过表达质粒,转染巨噬细胞后采用荧光定量PCR的方法检测ZEB2-AS1对巨噬细胞极化的影响。6.在滋养细胞外泌体孵育的巨噬细胞以及转染ZEB2-AS1过表达质粒的巨噬细胞中,采用western blotting检测巨噬细胞中信号通路分子的变化。7.CCK-8与EdU实验,检测滋养细胞外泌体诱导M2极化后的巨噬细胞对滋养细胞增殖能力的影响。结果:1.复发性流产患者的蜕膜巨噬细胞中M2的数量减少。2.滋养细胞外泌体具有双层膜结构,直径大小主要分布在100nm左右,可表达外泌体标志物HSP90、TSG101和CD9。且巨噬细胞可以摄取滋养细胞外泌体。3.滋养细胞外泌体孵育后的巨噬细胞呈现出与M2相似的外形;荧光定量PCR结果证实外泌体孵育后M2相关标志表达升高,而M1相关标志物无明显变化。Western blotting结果显示,外泌体孵育后巨噬细胞中精氨酸酶1的表达上调。4.外泌体芯片检测结果显示,相比于正常妊娠组,复发性流产组中有144个lncRNA 上调,230 个 lncRNA 下调。5.在滋养细胞外泌体诱导的M2中筛选出与芯片结果相一致的、高表达的lncRNAZEB2-AS1。将lncRNAZEB2-AS1过表达质粒转染巨噬细胞,可诱导其向M2极化。6.Western blotting结果显示,在滋养细胞外泌体和ZEB2-AS1过表达质粒诱导的巨噬细胞中,JNK以及p38信号通路均被激活。7.滋养细胞外泌体诱导的M2可反向作用于滋养细胞,并促进滋养细胞的增殖,维持妊娠的正常进行。结论:滋养细胞可通过外泌体lncRNAZEB2-AS1激活蜕膜巨噬细胞的JNK与p38信号通路而促进巨噬细胞向抑制型M2极化,建立和维持母-胎免疫耐受微环境;同时被诱导的M2又可反向作用于滋养细胞并促进其增殖分化,保证正常妊娠的顺利进行。而复发性流产患者滋养细胞外泌体中ZEB2-AS1低表达可能是导致其蜕膜巨噬细胞M2减少的原因。目的:长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lncRNA）是长度超过200个核苷酸的非编码RNA,不具备蛋白编码功能。目前,诸多研究证明lncRNA参与人体的多种生理和病理过程,并在其中发挥重要的作用。本课题在研究中发现lncRNA LINC01088在复发性流产患者的绒毛组织中表达上调,且与正常妊娠组相比差异显著。LINC01088表达升高的意义是什么?异常高表达的LINC01088会对滋养细胞的生物学功能产生什么影响?目前尚不清楚。为了解答这些问题,我们检测了 LINC01088对滋养细胞的增殖、侵袭、迁移以及分泌生物活性因子能力的影响,从多方面探讨了 LINC01088对滋养细胞的调控功能。方法:1.通过转染LINC01088的过表达质粒,成功构建LINC01088过表达的细胞模型。同时,通过CRISPR/Cas9实验技术构建LINC01088敲除的滋养细胞系。2.在LINC01088过表达或敲除的细胞中,通过CCK-8、EdU、克隆形成实验等检测LINC01088对滋养细胞增殖能力的影响。3.在LINC01088过表达的滋养细胞中,通过流式细胞术检测LINC01088对滋养细胞周期以及凋亡的影响;荧光定量PCR与western blotting检测LINC01088对细胞周期与凋亡相关分子的影响。4.在LINC01088过表达或敲除的滋养细胞或绒毛组织中,通过transwell实验、绒毛组织体外培养实验,检测LINC01088对滋养细胞以及绒毛组织侵袭与迁移能力的影响。5.在LINC01088过表达的滋养细胞中,通过荧光定量PCR实验检测LINC01088对滋养细胞分泌生物活性因子能力的影响,观察LINC01088过表达后,滋养细胞的分泌格局的变化。结果:1.LINC01088在复发性流产患者绒毛组织中的表达显著高于正常妊娠者。2.成功构建LINC01088过表达或敲除的滋养细胞模型。3.CCK-8、EdU、克隆形成实验结果显示,LINC01088过表达的滋养细胞（HTR8/SVneo和JAR）增殖能力明显减弱,而在敲除LINC01088后,HTR8/SVneo和JAR的增殖能力显著增强。4.LINC01088可通过阻抑G1期到S期的进展来抑制滋养细胞周期的进程,在此过程中,细胞周期相关分子CDK2、CDK4和cyclin E1表达受抑。5.LINC01088可通过抑制抗凋亡分子Bc12、促进凋亡分子Bax的表达以及caspase3的活化诱导滋养细胞的凋亡,尤其是晚期凋亡。6.LINC01088抑制滋养细胞的侵袭与迁移功能。7.LINC01088显著降低滋养细胞CXCL12的表达,但对CCL5、TGF-β、IL-10以及IL-35无明显影响。结论:LINC01088在复发性流产患者的绒毛组织中表达升高。高表达的LINC01088通过抑制滋养细胞的增殖、阻抑细胞周期演进、抑制细胞的侵袭与迁移及趋化因子CXCL12的表达、促进滋养细胞的凋亡等生物学功能,最终导致胚胎发育受抑和复发性流产的发生。目的:在第二部分研究中我们已经证实LINC01088可以显著抑制滋养细胞的增殖、侵袭与迁移,抑制细胞周期,促进滋养细胞的凋亡进而导致复发性流产的发生。但其具体机制并不清楚。LncRNA的转录本丰富,调控机制多种多样,可以通过转录、转录后调控、表观遗传调控等方面来参与基因的调节进而在多种疾病的病理过程中发挥重要作用。在本部分研究中,我们从探讨LINC01088在细胞中的定位入手,采用RNA pull-down技术结合蛋白质谱分析与western blotting实验,寻找出与LINC01088结合并可能发挥作用的蛋白,逐步深入探索LINC01088的作用机制。方法:1.分离滋养细胞的细胞质与细胞核RNA,并进行荧光定量PCR检测,明确LINC01088在滋养细胞中的定位。2.采用RNA pull-down技术结合蛋白质谱检测与LINC01088结合的蛋白,western blotting实验进行结果验证,明确与LINC01088结合并可能发挥作用的蛋白分子精氨酸酶1。3.通过荧光定量PCR以及western blotting实验,检测LINC01088对所结合的精氨酸酶1的稳定性的影响。4.通过western blotting实验以及一氧化氮检测试剂盒,确定LINC01088对一氧化氮/一氧化氮合酶系统的影响。5.通过western blotting实验检测在滋养细胞中LINC01088抑制滋养细胞的增殖、侵袭与迁移及诱导复发性流产过程中发挥作用的信号通路与分子。结果:1.在HTR8/SVneo和JAR细胞中,LINC01088主要定位于细胞核。2.LINC01088可以与精氨酸酶1结合,并增强精氨酸酶1蛋白的稳定性,对其mRNA的表达水平无明显影响。3.LINC01088可抑制内皮型一氧化氮合酶的蛋白水平,导致一氧化氮的水平同步减少。4.LINC01088 显著激活 JNK/P38 MAPK 信号通路,但对 β-catenin、NF-κB p65、IκB以及Erk MAPK通路分子及其磷酸化状态无明显影响。结论:LINC01088主要定位于滋养细胞的细胞核中,其过量表达后可以与精氨酸酶1结合,增强精氨酸酶1的蛋白稳定性,进而减少一氧化氮合酶的表达,致使一氧化氮的表达降低。降低的一氧化氮进一步激活JNK/P38 MAPK信号通路,导致滋养细胞的增殖、侵袭与迁移等功能受损并进一步诱导复发性流产的发生。