烟草病毒病是全世界烟草栽培区发生普遍,危害严重的一大类病害。目前世界上已报道发现的侵染烟草的病毒达47 种,我国有17 种。在田间,常表现为多种病毒混合侵染,给烟草生产造成重大损失,重病田减产20～50%,夏烟减产70%以上。对病毒病的快速检测和监控技术是病毒病防治的基础性工作,可提高病毒病防治的针对性和时效性;而植物抗病毒基因工程的发展,特别是RNA 介导的病毒抗性策略的提出,为植物病毒病的防治提供了新的途径。围绕着烟草病害的防治,本研究进行了两方面的探索。其一,分离、提纯马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯X 病毒(PVX)、烟草环斑病毒(TRSV),克隆了6 种病毒的外壳蛋白(CP)基因,并进行了序列分析,首次明确了PVY、PVX 和CMV 山东分离物在分类学上的归属地位。制备了不同病毒的抗体和酶标抗体,建立了以点免疫结合技术(DIBA)为基础的快速、多元的病毒检测体系,对山东烟草病毒病进行了初步调查,明确了主要病毒种类。其二,RNA 介导的病毒抗性策略应用于烟草病毒病防治的研究。在已获得不同抗病类型的转非翻译PVY-CP 基因烟草的基础上,研究了RNA 介导的病毒抗性遗传及外源基因的整合方式与RNA 介导的病毒抗性产生的关系,明确了RNA 介导的病毒抗性可稳定地遗传;揭示了转基因的结构对于诱发病毒抗性产生可能起关键的作用,并进而设计了发夹结构DNA 进行了验证。在此基础上,以烟草上危害最为严重的PVY、CMV和TMV 为材料,克隆并构建了包含3 种病毒部分CP 基因的发夹结构DNA 的植物表达载体,转化烟草,首次培育获得了抗3 种病毒转基因烟草。研究结果将为烟草病毒病的防治提供理论依据和技术支持,具有很好的理论和应用价值。具体研究结果如下: 1. 烟草病毒的检测新技术研究—烟草病毒病快速、多元检测技术的建立及应用1.1 病毒的分离从山东感病的烟草和马铃薯上,分离纯化了马铃薯Y 病毒(PVY-SD-TA)、马铃薯X 病毒(PVX-SD1)、烟草花叶病毒(TMV-SD1)、烟草蚀纹病毒(TEV-SD1)、黄瓜花叶病毒(CMV-SD1)和烟草环斑病毒(TRSV-SD1)等6 种烟草上常见的病毒。1.2 病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析