研究背景和意义：胃癌(Gastric cancer,GC)作为严重威胁人类健康的消化系统恶性疾病之一,尽管在过去的几年里其发病率有所减少,但其死亡率仍然在各大恶性肿瘤中高居第二位,在新发的病例中居第四位。现有的治疗手段中,手术切除和辅助化疗虽然取得了巨大的进步,甚至有些胃癌在早期是可以被治愈的。然而不幸的是多数患者被发现时已经处于晚期,原本有效的治疗方法变得效果不佳或无效。因此,迫切需要探索一种有效的肿瘤标志物用于早期诊断及改进治疗策略。最近,一种新的候选癌基因-肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(Tumor necrosis factor-a-induced protein 8, TNFAIP8),逐渐引起了学者们的关注。TNFAIP8也被称做GG2-1,SCC-S2,MDC-3.13。该基因在染色体上位于5q23.1并且存在于多数的恶性肿瘤组织中。近年来TNFAIP8在肿瘤形成中的一系列作用在不断被证实,这些结果表明,TNFAIP8在多种肿瘤的发生发展中起着重要作用,参与到肿瘤细胞的增殖,侵袭、迁移、凋亡和耐药性的众多过程。有研究表明TNFAIP8在肺癌,乳腺癌,胰腺癌,结肠癌等恶性肿瘤中均存在高表达,并与肿瘤的临床病理特征和预后有一定相关性,但其在胃癌中的表达和参与调节胃癌细胞生长,侵袭及迁移机制尚未确定。如果能明确其调节机制并找到相应的节点进行干预,或许对于胃癌的治疗,预后的改善有着非常重要的临床意义和应用前景。第一部分TNFAIP8在胃癌组织和细胞中的表达情况研究目的：明确TNFAIP8在胃癌组织和细胞中的是否存在表达,以及其表达情况与临床病理特征和不良预后的关系。材料：1.收集新鲜的胃癌组织和临近正常组织标本(4对)通过Western blot检测TNFAIP8相关蛋白表达水平。2.收集2007年1月1日至2008年7月1日期间山东大学附属省立医院收治86例胃癌确诊患者的胃癌组织及癌旁正常组织标本。所有入组患者遵循NCCN指南的治疗标准,均接受了根治性手术切除,所有患者在手术前未曾接受包括放疗或化疗在内的任何治疗。所有从患者和健康对照组获取的标本均取得受试者的知情同意和医院伦理委员会批准。所有患者术后病理均证实胃癌诊断。3.我们中心实验室保存有GES-1,MKN-28, SGC-7901,MGC-803细胞。人胃癌肿瘤细胞系NCI-N87由上海交大附属瑞金医院消化外科研究所提供。研究方法：用免疫荧光方法进行细胞质定位,再使用免疫组织化学染色和实时定量PCR检测来评估TNFAIP8在胃癌组织和细胞及其癌旁的正常组织和细胞中的表达,并通过对86名胃癌患者的长期随访进一步分析TNFAIP8与临床病理特征的关系及其预后的作用。1.组织标本的免疫组化染色和免疫荧光法从山东大学附属省立医院病理科调取所需的肿瘤组织进行常规的石蜡包埋,然后制成厚度为4μm的切片。随后组织切片依照SABC制造商的操作说明进行脱蜡。用0.3%的过氧化氢和阻断血清来阻断非特异性的内生性抗原。随后切片用PBS夜冲洗3遍,每遍5分钟。然后加入TNFAIP8兔多克隆抗体(1：100稀释),在4℃温度下孵育过夜。然后将组织切片再次经PBS液冲洗后,加入二抗,在37℃温度下继续孵育30分钟,然后组织切片加入DAB显色试剂盒和苏木素染色。以上实验步骤重复三遍,在此过程中同时应用免疫荧光技术来进行TNFAIP8蛋白在细胞中的定位。2.免疫组织化学染色法评价免疫组化染色后的组织切片由两名病理学专家进行评价,他们事先并不知道患者确切条件。其评分标准基于染色的强度及TNFAIP8表达的染色比例。对于染色强度来说其程度评分分类如下：0分(阴性),1分(弱),2分(中度),3分(强)。对于TNFAIP8表达染色的比例进行评分标度如下：0分(无表达),1分(表达<25%),2分(表达26%-50%),3分(表达51%-75%),和4分(表达>75%)。最后的结果是强度和比例分数的叠加。少于4分的被认为是低表达,4分以上的被认为是高表达。3.细胞培养我们中心实验室保存有GES-1, MKN-28, SGC-7901, MGC-803细胞。人胃癌肿瘤细胞系NCI-N87由上海交大附属瑞金医院消化外科研究所提供。细胞在RPMI 1640培养基中培养,同时放入10%灭活胎牛血清,青霉素(100U/L),链霉素(100mg/L)。培养环境为5% CO2潮湿环境,环境温度维持37℃。4.定量RT-PCR (qPCR)根据产品供应商(nvitrogen, Carlsbad, CA)的说明,采用TRIzol从细胞中提取出总RNA,将提取的RNA进行逆转录,所得的cDNA用基因特异性引物(大连1aKaRa公司)通过实时定量PCR (The LightCycler 480 Real-Time PCR System, Roche, China)进行扩增。引物对的序列如下：TNFAIP8上游引物：5’-TTCCATCAGGTGGATTATACCTTTG-3’;下游引物：5’-AGGTGGCGCTGAATGATTTG-3’。mRNA水平以GAPDH为内参。5. Western蛋白印迹分析简言之,组织和细胞经过洗涤,溶胞和收获。使用bicinchoninic acid protein assay Kit(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)蛋白浓度测定试剂盒对所得到的溶胞产物的蛋白浓度进行评价。适当量的蛋白质通过12%Tris-glycine聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到硝酸纤维素膜。纤维素膜封闭后加入TNFAIP8抗体,为兔抗人(1：500稀释,购置Abcam64988,USA),在4℃温度下孵育过夜。第二天,用TBST洗膜3次,每次10分钟。再放入相应的二抗孵育1小时。再次洗涤3次,每次10分钟后,用增强化学发光试剂(ECL,购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford, IL, USA)来检测结合二抗。蛋白水平的检测以β-actin为内参。6.统计分析采用SPSS18.0软件(SPSS inc. USA)进行统计分析。TNFAIP8在人胃癌细胞系和组织中的蛋白和mRNA表达检测实验至少重复三次独立的实验,高倍镜下细胞计数用均数士标准差表示。卡方检验和Fisher精确检验用于分类变量。P<0.05有统计学意义。研究结果：1.组织标本的免疫组化染色和免疫荧光法显示TNFAIP8在胃癌组织中及胃癌细胞系中存在表达,且表达定位于胞浆。2.在86例胃癌组织中有65例表达TNFAIP8,阳性率75.58%,86例癌旁组织中22例表达TNFAIP8,阳性率25.58%,p<0.05。说明TNFAIP8在胃癌组织中表达高于正常组织,且免疫组化染色评分显示,TNFAIP8的表达和肿瘤浸润深度及淋巴结转移情况相关(P<0.05),进一步研究显示86名患者中(T1和T2期的共30人,T3和T4期共56人),TNFAIP8在T3和T4期肿瘤中表达明显高于T1和T2期(p=0.0013),而不同T分期肿瘤相邻的正常组织中表达无明显差异(p=0.6831)。3.应用Western蛋白印迹分析,证实TNFAIP8蛋白在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达高于正常组织和正常胃粘膜细胞(P<0.05, Student’s t-test)。结论：1.TNFAIP8在胃癌组织中及胃癌细胞系中存在表达,且蛋白表达定位于胞浆。2.TNFAIP8的表达与胃癌浸润深度和淋巴结转移情况相关,研究表明TNFAIP8的表达上调和肿瘤临床病理特征和不良预后存在显著的相关性。3.TNFAIP8蛋白在胃癌组织中的表达高于正常组织。第二部分TNFAIP8对调节胃癌细胞生长,影响侵袭及迁移的研究研究目的：通过第一步实验,我们已经证实TNFAIP8在胃癌组织和细胞中的高表达,然后,我们研究小组将TNFAIP8基因敲除进而检测其潜在的调节机制以及与增殖,侵袭,迁移的关系。研究方法：1. 序列设计和载体构建小干扰RNA的处理:TNFAIP8基因的小干扰RNA由Shanghai Genechem Co. Ltd.合成。siRNA-TNFAIP8(5’-CCACCTTAATAGACGACACAA-3’)的DNA序列是根据人TNFAIP8 cDNA的核心序列设计的。那些根据产品供应商的操作说明成功的转染小干扰RNA的细胞将放在显微镜下进行观察转染率。2.慢病毒转染在96孔板上将SGC-7901 and MKN-28胃癌细胞预培养至5×103个细胞/每孔的浓度后立即以不同感染复数的慢病毒载体感染这些细胞直至它们达到50-60%的转染率。72小时后其感染的效果即可在倒置荧光显微镜上观察到。3. Western蛋白印迹分析同第一部分实验方法。4. 细胞克隆形成实验将胃癌细胞制成单细胞悬液,然后将1x103细胞置于直径60毫米内含4毫升完全培养基的培养皿中,在37-C的温度,5%C02环境中培养10天。计算随机选取的5个区视野的细胞数,以其均值±标准差作为结果,至少含有50个细胞的集落才有统计学意义。5.CCK-8细胞增殖实验胃癌细胞(8×102 cells)在含有100微升10%灭活胎牛血清的96孔培养板中,在37℃的温度5% CO2环境中持续培养24,48,72,96,120小时。使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8) (Dojindo C0038, Japan)来评估细胞数目。简而言之,将10μl的CCK-8加入到每个孔中,培养1小时的,检测各个孔在450nm的吸光值来计算细胞数目。每孔独立的重复六次。6. 侵袭和迁移检测行侵蚀检测时,依照厂家说明使用24孔板系统操作(24-well insert, 8-μm pore size; Corning, NY, USA)。用50毫升含有Matrigd胶平铺上层小室,再将3x105个细胞浓度的培养基200微升置于上层小室。侵袭实验需要在Transwell小室中铺入Matrigel胶,而迁移实验则不需要。最后,在两者检测中将膜切下来用苏木素染色并拍照。7. 统计分析所有数据读取等检测步骤重复进行三遍,指标进行统计学处理,采用SPSS统计软件进行分析,计量数值以均值±标准差表示,根据需要选用配对资料的t检验或单因素方差分析进行统计分析,选用双侧检验。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.在SGC-7901和MKN-28两种细胞系中,用小干扰RNA转染后进行TNFAIP8基因沉默,应用实时定量PCR和Western蛋白印迹分析证实,与对照组相比其蛋白表达和mRNA水平显著降低(P<0.01)。2.细胞克隆形成实验结果显示：SGC-7901组集落数：129.24-18.13；SGC-7901-siRNA组集落数：62.2±8.68；MKN-28组集落数：140.0±14.45；MKN-28-siRNA组集落数：56.8±6.11；p<0.05。该实验结果和CCK-8实验结果同样提示将TNFAIP8基因沉默后其细胞增殖能力明显受到抑制。3.细胞侵袭和增殖实验显示转染后的SGC-7901和MKN-28细胞,其繁殖能力,侵袭及迁徙能力显著下降(P<0.05)。结论：1.TNFAIP8基因沉默后,其蛋白表达和mRNA水平显著降低。2.细胞克隆实验和CCK-8实验显示TNFAIP8基因沉默后,细胞增殖能力明显降低。3.侵袭和迁徙实验显示TNFAIP8基因沉默后,细胞侵袭和迁移能力显著减弱。