研究背景及目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的隐袭起病、慢性进行性进展的神经系统退行性疾病,是痴呆最常见原因,约占老年痴呆的50%-70%,目前已成为全球第四大死亡原因,位列心血管疾病、恶性肿瘤、中风之后。随年龄增加,阿尔茨海默病发病率升高明显,65岁以后大约每5年就会增加一倍。流行病学数据显示,目前全世界有5000万人患有痴呆,预计到2030年将增加至近6500万人,2050年,这一数字将上升到1.52亿人左右。阿尔茨海默病典型临床表现包括记忆力下降、执行功能下降、进行性日常生活能力受损及性格改变等精神行为异常。阿尔茨海默病的组织病理学特点有特定的大脑区域神经细胞外β-淀粉样蛋白(amyloid P-protein,Aβ)沉积,以神经炎性斑(neuritic plaque,NP)/老年斑(Senile plaques,SP)形式存在,神经元内过度磷酸化tau蛋白聚集形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT),以及神经元死亡、胶质细胞增生和突触连接丢失。阿尔茨海默病确切发病机制尚不明确,目前有多种学说,主要有Aβ级联假说、tau蛋白假说、氧化应激假说、线粒体级联假说、胆碱能损害假说、免疫炎症异常假说、凋亡自噬假说、金属离子紊乱假说、神经血管假说等等。其中,Aβ级联假说仍然是目前主流学说,该学说认为Aβ在阿尔茨海默病的发生和发展中扮演着重要角色,Aβ的生成与清除失衡是导致神经元变性和痴呆发生的起始事件。Aβ寡聚体的积累最终触发一系列的病理生理变化,包括tau蛋白过度磷酸化、线粒体氧化应激、线粒体功能障碍、突触连接障碍、炎症反应等等。线粒体是真核细胞的能量工厂和氧化应激产物活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生的主要场所,涉及细胞内许多重要的生物学过程。有研究表明,线粒体功能障碍和氧化应激(Oxidation Stress,OS)是阿尔茨海默病的早期重要的病理生理变化,线粒体功能障碍导致神经元内细胞色素氧化酶活性降低、ROS产生增加、细胞内钙稳态失衡和线粒体ATP(三磷酸腺苷adenosine tri-phosphate,ATP)减少,启动神经细胞线粒体途径凋亡。线粒体途径凋亡是一种重要的内源性途径凋亡,在细胞凋亡的生物学过程中发挥了关键作用,主要依赖各种促凋亡/抑制凋亡蛋白及其所形成的各种复合物进行调节,从而达到促进或抑制细胞调亡的作用。线粒体内膜与外膜之间的跨膜电位构成线粒体膜电位,由线粒体内膜的质子泵不断消耗ATP泵出质子得以维持。线粒体途径凋亡启动后,线粒体膜电位降低或消失,细胞色素C(Cytochrome c,Cyto C)、Bax等促凋亡蛋白在线粒体和细胞质之间转移,细胞浆内天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(Cysteine aspartate-specific proteinases,Caspase)酶级联激活,启动细胞凋亡,进而细胞死亡。自噬是通过依靠溶酶体或者液泡(酵母)负责将不必要或功能失调的细胞质成分和细胞器降解和循环再利用,例如错折叠或累积蛋白质和受损细胞器(如线粒体等)。依靠该途径,可以减少细胞内老化的蛋白质和细胞器的积聚,在不利的生存条件下,维持细胞内物质处于动态平衡状态,维持细胞的正常生存。通过自噬及时选择性清除受损的功能失调线粒体,降低氧化应激反应,以维持线粒体质量控制,维持线粒体结构和功能的稳定性,对于细胞正常生长和代谢具有重要的意义,这个过程在包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病时常常出错。目前,针对阿尔茨海默病的主要治疗方案包括控制伴发精神障碍和改善认知功能的乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetyl-cholinesterase inhibitors,AChEIs)、N-甲基-D-门冬氨酸受体拮抗剂等对症治疗,能够改变/逆转阿尔茨海默病病理及病程的疾病修饰治疗方法还没有。鉴于阿尔茨海默病发病机制的复杂性,针对阿尔茨海默病病因修饰性治疗的药物尚都处于试验研究阶段,且均以失败告终,提示我们应该重新审视其核心发病机制,且侧重于选择“多靶点协同干预”的治疗方案。因此,研究针对致病因素的多作用靶点有效药物意义重大,我国传统中药或许可以作为一个治疗方向去探索和研究。虎杖苷(polydatin,PD)是从传统中药蓼科植物虎杖的干燥根和根茎中分离得到的一种有效单体成分,为白藜芦醇的衍生物,与白藜芦醇有相似的药理学作用。虎杖苷具有抗血小板聚集、抑制血栓形成、抗动脉粥样硬化、抗氧化应激、改善微循环、保护心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、抗休克、保护肝脏、减轻肺损伤、神经保护、镇咳、平喘、免疫调节和抗肿瘤活性等多种药理学作用。目前,关于虎杖苷神经保护作用的研究,逐渐成为神经科领域关注的热点,研究方向多集中在缺血性脑血管病方面,在阿尔茨海默病治疗领域的研究尚不多。目的:本研究通过观察虎杖苷对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响,探索虎杖苷对神经元的保护作用以及其可能的机制。方法:1、使用虎杖苷和Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞,MTT法测定细胞活力,确定构建AD细胞模型的Aβ25-35的浓度、作用时间及后续实验中虎杖苷的浓度。2、各组SH-SY5Y细胞给予Aβ25-35和虎杖苷处理后,用Annexin V-FITC/PI双染细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率;分离SH-SY5Y细胞的细胞浆和线粒体,Western blot法测定细胞浆/线粒体内凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、CytoC、Bax 的表达水平。3、各组SH-SY5Y细胞给予Aβ25-35和虎杖苷处理后,Westen blot法检测细胞自噬相关蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1的表达水平。4、各组SH-SY5Y细胞分别给予自噬抑制剂Bafilomycin A1、Aβ25-35和虎杖苷处理后,用AnnexinV-FITC/PI双染细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率;分离SH-SY5Y细胞的细胞浆和线粒体,Western blot法测定细胞浆/线粒钵内凋亡相关蛋白 cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、CytoC、Bax 的表达水平。5、各组SH-SY5Y细胞给予自噬抑制剂Bafilomycin A1、Aβ25-35和虎杖苷处理后,采用DCFH-DA测定细胞内ROS含量;JC-1染色,流式细胞仪检测线粒体膜电位变化;使用CellTiter-Glo测定细胞内ATP水平变化。结果:1、MTT法测定细胞活力结果显示:只给予Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞时,与正常对照组相比,1 0μM的Aβ25-35诱导SH-S Y5 Y细胞损伤24小时细胞活力下降64.28±4.73%,下降程度适宜,可构建AD细胞模型;只给予不同浓度虎杖苷处理SH-SY5Y细胞24小时,细胞活性无明显改变;虎杖苷预处理联合Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞时,与Aβ组相比,50μM、100μM、200μM、300μM的虎杖昔预处理SH-SY5Y细胞组细胞活力均明显升高,且100μM的虎杖苷组与200μM、300μM的虎杖苷组无明显差异。2、虎杖苷通过抑制线粒体凋亡途径抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡:流式细胞仪结果提示虎杖苷预处理可以显著抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,与正常对照组相比较,Aβ组SH-SY5Y细胞凋亡数目明显增多;与Aβ组相比,虎杖苷+Aβ25-35组细胞凋亡数目明显减少。Western blot结果显示:与正常对照组相比,Aβ组细胞质中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、CytoC蛋白表达水平明显上调,线粒体中CytoC蛋白表达水平明显下调,Bax蛋白表达水平明显上调。与 Aβ 组比较,虎杖苷+Aβ25-35 组细胞质中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Cyto C蛋白表达水平明显下调,Bax蛋白表达水平上调,线粒体中Cyto C蛋白表达水平明显升高,Bax蛋白表达水平降低。以上结果表明,虎杖苷可以通过抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞线粒体途径凋亡,进而抑制细胞凋亡发生。3、虎杖苷可促进SH-SY5Y细胞自噬:Western blot法检测结果显示,与正常对照组相比,Aβ组细胞质中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表达水平上调,与Aβ组相比,虎杖苷+Aβ25-35组SH-SY5Y细胞质中LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达水平均明显上调。以上结果提示,虎杖苷可促进SH-SY5Y细胞自噬。4、虎杖苷通过促进细胞自噬抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡:流式细胞术结果表明,与Aβ组相比,虎杖苷预处理后可以明显抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,当增加自噬抑制剂BafA1预处理后,与虎杖苷+Aβ25-35组相比,BafA1预处理+虎杖苷预处理+Aβ25-35损伤组细胞凋亡明显增加,虎杖苷抑制细胞凋亡作用被部分抵消。Western blot结果显示,与Aβ组相比,虎杖苷+Aβ25-35组细胞质中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Cyto C蛋白表达水平明显下调,Bax蛋白表达水平上调,线粒体中CytoC蛋白表达水平明显升高,Bax蛋白表达水平降低。与虎杖苷+Aβ25-35组相比较,BafAl+虎杖苷+Aβ25-35组细胞质中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、CytoC蛋白表达水平明显上调,Bax蛋白表达水平下调;线粒体中CytoC蛋白表达水平明显减少,Bax蛋白表达水平升高。以上结果表明,虎杖苷通过促进细胞自噬抑制SH-SY5Y细胞线粒体途径凋亡,进而抑制细胞凋亡发生。5、虎杖苷通过促进自噬降低Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激和改善线粒体功能障碍:流式细胞仪检测线粒体膜电位变化显示,与Aβ组相比,虎杖苷预处理后,JC-1单体数显著减少,显著抑制线粒体膜电位下降;当加入自噬抑制剂BafA1后,与虎杖苷+Aβ25-35组相比,BafA1预处理+虎杖苷预处理+Aβ25-35损伤组细胞JC-1单体数显著增加,虎杖苷抑制线粒体膜电位下降的作用被部分逆转。虎杖苷可显著增加Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞内ATP含量,自噬抑制剂BafA1则部分抑制虎杖苷对SH-SY5Y细胞内ATP含量的增加。虎杖苷可显著降低Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞内ROS的水平,自噬抑制剂Baf A1则部分逆转了虎杖苷的这种作用,使SH-SY5Y细胞内ROS含量增加。以上结果提示,虎杖苷通过促进细胞自噬降低SH-SY5Y细胞氧化应激和改善线粒体功能障碍。结论:1、虎杖苷通过抑制线粒体途径凋亡抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。2、虎杖苷可促进SH-SY5Y细胞自噬。3、虎杖苷通过促进细胞自噬抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞线粒体途径凋亡,进而抑制细胞凋亡。4、虎杖苷通过促进细胞自噬降低Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激和线粒体功能障碍。