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神经营养因子(Neurotrophic Factors,NTF)是机体产生的调控神经细胞存活、生长、分化的一类可溶性蛋白质,周围神经损伤后内源性神经营养因子的不足是导致神经再生障碍及功能恢复不良的重要原因,联合应用多种外源性神经营养因子促进神经再生已逐步成为进一步提高神经修复疗效的重要方法。但目前有关多种神经营养因子的联合应用还存在需要进一步研究的问题:其一是不同种类的外源性神经营养因子之间的配方以及使用的时间和剂量问题。各种神经营养因子对神经元的作用具有一定选择性和交叉性,选择适当的神经营养因子组合才能发挥协同作用,产生复合生物学效应。此外,由于周围神经损伤后不同神经营养因子的表达变化差异很大,有的表达增加,有的表达降低,且增加(或降低)的幅度和时相有所不同,必须根据各种因子在损伤后表达的变化特点有针对性地确定该因子使用的时间和剂量,才能最大效率地促进神经再生。其二是不同神经神经因子表达的检测问题。以往由于不同的研究者所采用的实验动物、损伤模型、表达检测方法和定量方法各不相同,对不同神经营养因子的表达,其结果之间的可比较性受到影响,甚至针对同一种神经营养因子在神经再生过程中的变化趋势,不同研究者的实验结果也不尽相同。因此,在相对一致的条件下同时检测多种神经营养因子的共表达对准确了解神经再生过程中各种神经营养因子的变化规律尤为重要。其三是再生神经结构重建的评价问题。现有的二维平面观察难以准确、完整地反映再生神经组织的解剖结构。针对上述三个问题,本课题以三种典型的神经营养因子NGF(nerve growth factor,神经生长因子)、CNTF(ciliary neurotrophic factor,睫状神经营养因子)和GDNF(glial cell line- derived neurotrophic factor,胶质细胞源性神经营养因子)为研究对象,基于大鼠背根神经节感觉神经元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)、脊髓前角运动神经元(spinal motor neurons,SMN)与雪旺细胞(Schwann cells,SCs)共同培养模型建立多种神经营养因子共表达的可视化和数量化的检测分析方法,探明三种神经营养因子共表达的变化规律;在此基础上根据NGF、CNTF和GDNF共表达的变化特点,确定联合应用外源性NGF、CNTF和GDNF促进大鼠坐骨神经再生的合理给药方式,并通过体内外实验阐明并验证联合应用外源性NGF、CNTF和GDNF对周围神经再生的协同促进作用;最后从方法学角度探讨周围神经组织显微结构的三维成像技术,从而更为准确地评价神经营养因子对再生神经结构恢复的促进作用。经过上述研究获得如下结果和结论:(1)多种神经营养因子在活细胞条件下的