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背景:特发性肺纤维化(IPF)的防治一直是各国重点开展研究的领域。目前应用糖皮质激素和细胞毒性药物仍是其临床上治疗的主要措施,但并不能有效抑制肺纤维化的进展,改善其肺功能或者延长其生存期限。随着对该病的发病机制的理解加深,许多新型药物不断被研制出来,但其应用于临床方面仍然存在着诸多问题。因此,找寻出新的预防或治疗方法迫在眉睫。间充质干细胞(MSC)能够向组织损伤处趋化迁移,参与修复作用,同时容易被外源基因转染和表达,在特发性肺纤维化的治疗方面已显现出巨大的应用前景。由于涉及氧化应激,N-乙酰半胱氨酸、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化剂也逐渐出成为特发性肺纤维化的新型治疗措施。而硫氧还蛋白(Trx)作为一种抗氧化剂,除了能够清除自由基,在抑制细胞凋亡和调节细胞周期等方面也具有非常重要的作用。所以,通过慢病毒转染,我们构建出目的基因Trx-1修饰的MSC,同时建立了博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型,为基因修饰的MSC治疗特发性肺纤维化奠定了一定的实验基础。方法:从NCBI网站查得Trx-1的CDS区序列,构建针对CDS区的基因特异性引物,并在引物两头加上可以和慢病毒载体同源重组的15bp左右的序列。在载体酶切线性化后,进行载体与基因片段的重组,将片段构建到载体上,最后通过荧光直接观察与Western Blot实验验证质粒的表达效果并通过荧光观察法计算得到病毒在293T细胞中的滴度。制备携带目的基因Trx-1的重组慢病毒Lentivirus-Trx-1,并测定病毒的滴度;设置一定的感染复数(MOI)梯度:0、5、10、30、50,用不同MOI值感染人脐带MSC,通过观察其荧光蛋白的表达确定其最佳MOI值,随后以空载体转染的人脐带MSC和未转染的人脐带MSC作为对照,利用重组慢病毒以最佳MOI值感染人脐带MSC,应用Western Blot检测细胞中目的蛋白Trx-1蛋白的表达情况;流式细胞术检测细胞的细胞周期、免疫表型;CCK-8法测定并绘制出细胞的生长曲线;以博来霉素作为诱导剂,以C57BL/6J小鼠作为实验动物,分别按照5mg/kg的用量经气管内注入博来霉素,或者按照用量约6mg/kg的用量经鼻滴入博来霉素,建立两种肺纤维化动物模型,通过对其一般情况、体重的观察和肺组织HE染色和Masson染色等病理染色,观察并比较两种造模方法的效果。结果:成功构建了pGC-LV-Ubi-TRX-1-CMV-EGFP慢病毒载体质粒,并通过Western Blot发现此质粒在293T中成功表达,并发生翻译后修饰,同时利用293T细胞测得了病毒的滴度为1×108 TU/ml;当MOI值为10及以上时,MSC的感染效率均能达到80%以上,由于慢病毒可能具有细胞毒性,最佳MOI值确定为10。Western Blot检测显示各组细胞均能不同程度地表达Trx-1蛋白,并且实验组目的蛋白Trx-1的表达明显增加;流式细胞术检测发现,三组MSC均高表达CD105、CD73,不表达CD34、CD80等,符合MSC的表型特点;细胞周期检测显示,慢病毒感染前后,人脐带MSC均有80%以上的细胞处于G0/G1期,提示转染慢病毒后的人脐带MSC与转染前类似,同样具有典型的干细胞特性;而通过对其生长曲线的观察对比则发现,与转染前不同,转染后实验组人脐带MSC生长受到抑制;造模结果发现,经气管内注入和经鼻滴入博来霉素均能成功建立肺纤维化模型。但通过对进行其病理纤维化评分后发现,与气管内给药相比,经鼻给药造模后小鼠肺组织病理改变较轻,提示气管内给药更容易造模成功。结论:成功构建了携带有人Trx-1基因的重组慢病毒载体,通过其介导获得修饰的人脐带MSC并能稳定高表达目的蛋白Trx-1,且其细胞学特性无明显改变;在本实验中,手术经气管内注入博来霉素后第28天诱导建立的C57小鼠肺纤维化模型成模最好,是一种复制肺纤维化的较好模型;本研究将基因治疗与细胞治疗相结合,为治疗特发性肺纤维化奠定了一定的实验基础,提供了新的可能手段。