研究背景心肌结构组织内的胶原纤维异常积累,而导致心肌内胶原的浓度明显升高或是胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)增多,各种类型的胶原排序混乱及比例失衡的现象叫做心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)。大多研究表明,MF是多种疾病如心力衰竭、高血压和心肌梗死等心血管疾病的一种基础病变,同时也是心肌组织重新构象的表现之一。心肌纤维化的发展过程受到包括免疫系统、机体细胞因子和RAAS系统在内的多种因素影响,不同型别的心肌纤维化的发生机制并不完全相同。同时MF的形成机制也受到血管紧张素、内皮素、一氧化氮、转化生长因子、结缔组织生长因子和细胞内钙离子等多种因素的调节。从整体来说,心肌细胞外基质胶原的合成、代谢和降解不平衡导致了心肌纤维化的发生。心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)足心肌细胞外基质分泌的主要细胞,它具有较强的增殖能力,没有收缩能力,主要负责心脏细胞间质的产生和沉淀。心肌成纤维细胞可以调节自身胶原物质的形成及心肌细胞的结构和功能,这是通过不断合成和分泌生物活性物质实现的。同时,它可以与心肌细胞、内皮细胞间相互作用,调节电机械能力、细胞因了的分泌和血管的生成。正常情况下,成人CFs处于平衡静止的状态。病理条件下,CFs表型发生转换,可转化为肌成纤维细胞—一种分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)能力更强的细胞,从而表达αα-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmscleactin,α-SMA)导致胶原合成、分泌增多。这可以看做是心肌纤维化的一个重要发生机理。因此,为有效预防和治疗心肌纤维化,需进一步探索CFs表型转化的可能调控机制,找到肌成纤维细胞的作用靶点。微小RNA分子(MicroRNA,miRNA)广泛存在于生物体内,是一种在生物进化过程中较为保守的非编码小分子RNA。它通过调控基因的表达、转录和翻译,在生命进程和疾病发生发展过程中有重要作用。心血管系统中有独特的miRNA表达系统。已有研究表明,miRNA可通过直接抑制多种细胞外基质蛋白表达和调控多种与纤维化相关的信号通路参与纤维化过程,广泛参与诸如高血压、糖尿病、心肌梗死等心血管疾病的心肌纤维化过程。目前关于miRNA与心血管系统疾病的关系尚处于开始阶段,而已有结论大多来自于体外动物实验,miRNA在人类心血管系统疾病发生过程中的作用机制还有待进一步的明确。随着研究的不断深入,发现Wnt/β-catenin信号通路与miRNA之间的相互作用对疾病发生及发展有重要的调控作用。Wnt信号通路是一类可以调控组织器官发育,参与细胞增殖、分化和转移的重要信号转导通路。它由一个复杂的蛋白质网络系统构成,包括多种调控Wnt信号分子合成的蛋白质。Wnt信号通路既可以参与成年人正常的生理过程,也可以调节胚胎及癌症的形成。大多研究证实,它在肝、肾、肺及心肌纤维化等纤维化疾病的发生过程中有重要作用。其作用机制可能是可以激活纤维化的效应细胞,但具体的作用机制尚不明确。Wnt信号通路主要包括经典和非经典通路,Wnt/β-catenin是最为典型的一个通路,β-catenin是该通路中的一个最为重要的信号分子。信号传导过程中受多种抑制因子的影响,如分泌型卷曲蛋白(SFRP家族)和WIF-1和DKKs家族。国内外已有研究发现,它可能对纤维化疾病的发生和效应细胞的激活有调控作用,存在器官之间的差异性,具体的发生机制尚不明确。已有研究表明,miRNA和Wnt信号转导通路之间在心肌纤维化过程中可能存在调控关系。但是,目前对于Wnt信号通路与miRNA之间的作用具体机制尚不明确,两者在心肌纤维化中的相互调控关系还有待深入研究探讨。miR-154是人类染色体14q32上的一个miRNA,在肿瘤研究中有较高的表达,在纤维化疾病中,目前只有其在肺纤维化中的作用研究,在心肌纤维化中研究较少。有研究表明,miR-154等一系列microRNAs的异常表达能导致心肌肥厚与心力衰竭。DKK(Dickkopf)是一种渐进性保守小基因家族,是分泌型糖蛋白的一种,是经典Wnt通路的抑制因子。有研究发现miR-154在DKK2、SFRP4、WIF-1上具有靶位点,这说明miR-154有可能通过调控上述因子而激活Wnt通路。综上所述,我们推测miR-154可以在心肌成纤维细胞中表达,并且在心肌纤维化过程中呈现上升趋势。miR-154和Wnt信号通路之间也可能存在某种调控作用。因此本研究以人心肌成纤维细胞为研究靶点,观察miR-154诱发心肌纤维化表达的变化情况,并探讨miR-154对Wnt信号传导通路在心肌纤维化过程中可能的作用。研究目的探讨miR-154对心肌纤维化的调控作用,进一步明确miR-154与Wnt通路之间存在的调控机制,为临床心肌纤维化的治疗探寻新的干预靶点。研究方法1、第一部分,采用由ScienCell实验室(Carlsbad,CA,USA)提供的人心肌成纤维细胞进行培养传代,合成miR-154模拟物和抑制物并转染到成纤维细胞中,采用BrdU检测细胞增殖率,采用Western blot方法检测Ⅰ和Ⅲ型胶原、a-SMA(肌样成纤维细胞标记物)的表达,以探讨miR-154对心肌纤维化过程的影响。2、第二部分,应用生物信息学方法,并结合现有文献对miR-154的靶基因进行预测,寻找miR-154参与调控Wnt/β-catenin信号通路的线索。登录miRBase、miRanda和TargetScan基因数据库预测和分析miR-154调控心肌纤维化可能作用于Wnt/β-catenin信号通路的靶点。将靶基因的3’UTR克隆到psiCHECK-2中,同时将预测的miR-154结合位点进行突变,然后分别与miR-154的模拟物转染293T细胞,进行双荧光素酶活性检测。在明确miR-154的靶基因后,进一步验证miR-154调控心肌成纤维细胞活化是否通过所在靶基因的通路(Wnt/β-catenin通路)进行。首先构建已找到的靶基因DKK2过农达载体和合成靶基因的siRNA。实验分组分为7组,分别为:空白对照组、阴性对照组、miR-154抑制物转染组、miR-154模拟物转染组、DKK2过表达载体转染组、DKK2-siRNA转染组、miR-154模拟物+DKK2过表达载体共转染组。各组分别转染成纤维细胞后,用Wstern blot检测miR-154靶基因、β-catenin、a-SMA、Ⅰ和Ⅲ型胶原的表达;用BrdU检测成纤维细胞的增殖;采用PI染色流式细胞技术分析细胞周期的改变及凋亡情况;用Transwell检测细胞迁移。研究结果1、CFs转染miR-154模拟物和miR-154抑制物后,BrdU检测结果发现,miR-154模拟物组的细胞增殖率高于miR-154抑制物组(P<0.01)。进一步用Western blot检测后发现,miR-154模拟物组成纤维细胞中α-SMA、collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白表达增高,而miR-154抑制物组中α-SMA、collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白表达有所降低,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。2、通过检索miRBase、miRanda和TargetScan基因数据库,结合文献分析方法,我们发现,DKK2是miR-154在Wnt/β-catenin信号通路中的一个靶基因。进一步进行荧光素酶活性检测发现转染克隆有DKK2野生型3’UTR的载体时,与对照组相比荧光素酶活性显著下降(P<0.01);而转染克隆有突变型DKK23’UTR的载体时,荧光素酶活性变化不显著。说明了DKK2是miR-154的一个作用靶点。3、用miR-154干预成纤维细胞,经Western blot检测结果显示,miR-154能上调β-catenin、a-SMA、Ⅰ和Ⅲ型胶原在心肌成纤维细胞中的表达(P<0.01),而用siRNA下调DKK2表达时也能显著上调上述蛋白的表达(P<0.01);当转染miR-154抑制物后,β-catenin、a-SMA、Ⅰ和Ⅲ型胶原的表达显著下降(P<0.01)。4、BrdU检测发现,转染miR-154模拟物时,CFs的增殖能力明显增强(P<0.01);下调DKK2表达时,CFs增殖也明显上调(P<0.01)。5、流式细胞分析方法发现,抑制miR-154表达或过表达DKK2时,Sub-G1峰的比例明显增加,会促进成纤维细胞的凋亡,miR-154过表达或DKK2表达下调时,会抑制成纤维细胞的凋亡。6、Transwell法检测细胞迁移发现,miR-154能增强CFs的迁移能力(P<0.01),DKK2过表达时,CFs的迁移能力显著下降(P<0.01)。研究结论1、miR-154影响心肌成纤维细胞的活化,诱导心肌成纤维细胞的增殖。2、miR-154靶向作用于DKK2基因激活Wnt信号通路,诱导心肌成纤维细胞增殖并转化为肌成纤维细胞,促进心肌ECM大量蓄积。3、miR-154靶向作用于DKK2基因激活Wnt信号通路,可以促进心肌成纤维细胞的增殖和迁移。