BHD综合征(Birt-Hogg-Dubésyndrome)是由FLCN(folliculin)基因突变所引起的一种动物遗传疾病。现有证据表明FLCN蛋白参与了多种生物过程,包括信号转导、细胞粘附、溶酶体和线粒体的生物合成、细胞能量代谢和营养稳态等,但缺失FLCN导致BHD综合征的具体原因仍不清楚。通过对FLCN蛋白三维结构的研究发现其C末端具有一个DENN结构域,这一结果提示FLCN可能通过与某些Rab家族蛋白成员发生作用进而调控细胞内的囊泡运输过程。然而由于对被运输的货物分子尚缺乏了解,FLCN在囊泡运输中的具体功能还有待实验证实。质子协同氨基酸转运蛋白1(proton-assisted amino acid transporter 1,PAT1,又称SLC36A1)是一个在哺乳动物体内广泛分布的跨膜氨基酸转运蛋白。在多种类型的细胞里,PAT1主要定位在溶酶体表面,PAT1还可以定位在其它部位,包括细胞膜、伪足,神经细胞的轴突和突触小泡等。在大鼠平滑肌细胞,PAT1甚至定位在细胞核。这些结果说明PAT1的定位受多种机制调控,PAT1在不同细胞里执行的生理功能与其定位有关。本研究组的前期研究发现,在人胚胎肾细胞HEK293中,FLCN抑制PAT1定位在溶酶体:当FLCN的表达被抑制时,PAT1募集到溶酶体表面,促进将溶酶体内储存的氨基酸释放进入细胞质。由于溶酶体内的氨基酸是激活营养代谢关键调控因子mTORC1的一个重要信号,溶酶体内氨基酸浓度下降导致mTORC1活性降低。在真核细胞里,膜蛋白在细胞内的定位主要通过囊泡运输来实现,我们推测PAT1可能是FLCN执行囊泡运输功能的一个货物分子。为了探索FLCN调控PAT1定位的机制,进而揭示FLCN在囊泡运输中的潜在功能,本研究以体外培养的HEK293细胞为主要研究模型,使用多种细胞生物学和生物化学技术,对PAT1在细胞内的运输途径以及FLCN调控PAT1定位的机制展开了深入研究,获得了如下主要发现:1.PAT1在多种囊泡上都有定位。免疫荧光染色结果显示,PAT1与多种囊泡标记蛋白存在共定位,包括LAMP1(溶酶体)、Rab5A(早期内体)、EEA1(早期内体)、TGN38(反式高尔基体)、Chmp5(多囊体)、Rab7A(晚期内体)、M6PR(晚期内体和循环内体)、Rab11A(循环内体)等。其中,PAT1主要定位在溶酶体,PAT1与其它囊泡也存在不同程度的共定位,这些发现提示PAT1可以沿着内吞(endocytosis)和再循环途径(endocytic recylcing)在细胞内运输。2.细胞内吞实验(internalization assay)显示位于细胞膜上的PAT1可以通过内吞进入细胞,并最终定位于溶酶体,说明PAT1可以通过间接运输方式被运输到溶酶体。3.FLCN抑制PAT1定位到溶酶体,促进PAT1定位到细胞膜,正向调控mTORC1。通过RNA干扰的方法抑制FLCN表达(FLCN-RNAi),或者敲除FLCN基因(FLCN-/-),导致PAT1的水平在溶酶体表面增多,在细胞膜上减少,细胞的mTORC1活性降低。缺乏氨基酸导致PAT1在溶酶体表面富集以及mTORC1活性下降;提高FLCN的表达量可以抑制PAT1在溶酶体募集,使细胞在氨基酸缺乏的情况下仍可维持较高水平的mTORC1活性。4.FLCN与回收运输调节因子Rab11A存在相互作用。免疫共沉淀(co-IP)实验结果显示,FLCN可以结合Rab5A、7A、11A,但FLCN与Rab7A和Rab11A结合较强,与Rab5A的结合较弱;FLCN通过DENN结构域与Rab11A结合。5.Rab11A抑制PAT1定位到溶酶体,促进PAT1定位到细胞膜,这与FLCN的作用一致。抑制Rab11A表达(Rab11A-RNAi),或者过表达失活形式的Rab11A突变体(S25N)导致PAT1的水平在溶酶体表面增多,在细胞膜上减少,mTORC1活性下降;反之,过表达活性形式的Rab11A(Q70L)抑制PAT1定位到溶酶体,并缓解过表达PAT1对mTORC1的抑制作用。6.体外GEF活性检测实验显示,FLCN不能直接调控Rab11A的活性,这与已有的报道一致。然而我们发现FLCN促进Rab11A与PAT1结合:在FLCN缺失的背景下,PAT1与Rab5A或Rab7A的结合不受影响,但PAT1与Rab11A的结合能力显著降低。根据以上发现,我们尝试得出两个结论:(1)FLCN是Rab11A的一个效应因子,FLCN通过DENN结构域与Rab11A结合;(2)FLCN通过将PAT1与Rab11A绑定促进PAT1向细胞膜(或高尔基体)方向运输,因而抑制PAT1向溶酶体方向运输。本研究揭示出FLCN与Rab11A之间的一种关系,发现了FLCN在回收运输中的新功能,为进一步阐明BHD综合征的发病机理提供了新线索。