p400(基因符号Ep400)被鉴定为新型腺病毒E1A结合复合物,属于SWR1类DNA依赖性染色质重塑ATP酶,含有SWI2/SNF2型的ATP酶结构域、SANT结构域、HAS结构域以及富含谷氨酰胺的结构域。p400在DNA损伤、组蛋白置换、细胞周期与着床后胚胎发育等过程中发挥重要作用。然而,当前对于p400在小鼠植入前胚胎发育过程中的功能所知甚少。因此,本研究重点探索p400在小鼠植入前胚胎发育过程中发挥的功能。一、检测小鼠各阶段植入前胚胎中p400的动态变化。收集小鼠合子(10h)、2-细胞(24h)、4-细胞(48h)、桑椹胚(72h)、囊胚(96h)五个时期的植入前胚胎与小鼠生发泡(germinal vesicle,GV)时期的卵母细胞,使用免疫荧光染色技术检测p400蛋白在植入前胚胎中的表达。显示p400在小鼠植入前胚胎各个时期均有表达,并且主要表达于细胞核中。随着小鼠植入前胚胎的发育,p400在受精前的GV时期至受精后的2-细胞时期表达量逐渐升高,4-细胞时期表达量降低,桑椹胚至囊胚时期再次升高,并且在囊胚时期达到最高表达量。接着通过实时荧光定量PCR检测p400的mRNA总量在小鼠植入前胚胎发育各个阶段的变化。以GV期卵母细胞的p400 mRNA表达量为对照,实时荧光定量PCR结果表明,合子时期p400表达量没有明显变化,2-细胞时期p400表达量上升,4-细胞时期下降且与GV期卵母细胞表达量相当,囊胚至桑椹胚阶段持续下降,在囊胚时期p400 mRNA表达量降至最低。二、构建Ep400基因敲除的细胞系。为更好的研究p400对小鼠植入前胚胎发育的影响,利用CRISPR-Cas9技术在小鼠胚胎成纤维细胞中敲除Ep400基因,探究其对细胞生长发育的影响。构建敲除载体,采用单位点与双位点的方法敲除Ep400基因。经过研究对比发现,在Ep400基因选取的外显子两侧设计sgRNA,进行双位点敲除,可以形成片段性删除,有效地对Ep400基因进行敲除。Ep400基因成功敲除后,筛选敲除Ep400基因的小鼠胚胎成纤维细胞单克隆细胞系。利用Ep400基因敲除的细胞系,探究p400对小鼠胚胎成纤维细胞生长的影响,进一步为探索p400对小鼠植入前胚胎发育的影响奠定基础。三、敲减Ep400基因对小鼠胚胎成纤维细胞增殖的影响。利用shRNA对Ep400基因进行敲减,通过CCK-8实验检测其对NIH 3T3细胞增殖能力的影响。结果表明,敲减Ep400基因,小鼠胚胎成纤维细胞从48h后表现出增殖能力下降。