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目的:研究多聚左旋精氨酸(Poly-L-arginine,PLA)诱导气道上皮细胞NCI-H292细胞凋亡的通路机制以及对细胞内Bcl-2/Bax、Caspase-3表达的影响,从而揭示PLA参与哮喘气道上皮损伤的部分机制。方法:1、细胞培养常规培养基(RPMI1640+10%胎牛血清)培养NCI-H292细胞,于37℃、5%二氧化碳环境的培养箱内孵育。每2~3天换液一次,细胞分裂铺展至培养瓶70%~80%时用0.25%胰酶消化传代,用于后续实验。2、透射电镜制片观察NCI-H292细胞凋亡NCI-H292细胞分为对照组、PLA(60 mg/L)组两组,PLA作用24 h后,收集细胞,固定后脱水,包埋干燥,切片浸染后用透射电镜摄片观察两组细胞的超微结构。3、Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率按加入PLA浓度不同将细胞分为空白对照组、10 mg/L PLA组、20 mg/L组PLA、40 mg/L PLA组、60 mg/L PLA组,按是否加入ERK1/2信号通路抑制剂PD98059分为空白对照组、PD组、PLA组、PLA+PD组。收集各组细胞后,运用流式细胞仪检测凋亡率,flowjo软件分析凋亡结果。4、Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Casepase-3及信号通路ERK1/2的表达采用Western Blot法分析在不同浓度PLA(0、10、20、40、60 mg/L)刺激下Bax、Bcl-2、Casepase-3和ERK1/2的蛋白含量,并比较ERK信号通路抑制剂PD98059(20μmol/L)作用前后对Bcl-2/Bax、Casepase-3和ERK1/2磷酸化的影响。5、统计学处理采用统计学软件SPSS16.0进行处理分析,数据以(?)x±s表示,数据均进行正态性检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA);两两间比较采用LSD-t检验。所有实验均重复不少于3次。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、电镜下可见PLA刺激后的NCI-H292细胞核膜皱缩外突,染色质在核膜下浓聚;线粒体肿胀变圆、呈空泡状,线粒体嵴排列杂乱多不规则,数量明显减少,甚至部分消失,呈明显凋亡改变。2、Annexin V-FITC/PI双染法凋亡检测显示,对照组、10 mg/L PLA组、20 mg/L PLA组、40 mg/L PLA组、60 mg/L PLA组NCI-H292细胞凋亡率分别为(4.97±0.17)%,(7.82±0.21)%,(11.99±0.21)%,(29.52±0.55)%,(55.23±0.67)%,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001),并呈浓度依赖性。3、Western Blot检测10 mg/L PLA组、20 mg/L PLA组、40 mg/L PLA组、60 mg/L PLA组的Bcl-2/Bax比值相对于空白对照组皆显示降低趋势,差异都有统计学意义(P均<0.01);在活性Caspase-3蛋白表达水平的检测中,10 mg/L PLA组、20 mg/L PLA组、40 mg/L PLA组、60 mg/L PLA组的活性Caspase-3蛋白表达量比之于对照组都有所增加,有统计学差异(P均<0.001)。4、与空白对照组相比较,10 mg/L PLA组、20 mg/L PLA组、40 mg/L PLA组、60mg/L PLA组ERK磷酸化水平均增加(P均<0.01),且在PLA终浓度为20mg/L时,P-ERK/ERK的表达量达到高峰(P<0.01)。5、空白对照组、PD组、PLA组、PLA+PD组NCI-H292细胞凋亡率分别为(5.04±0.26)%、(4.99±0.19)%(P=0.801)、(20.72±1.37)%(P<0.001)、(8.67±0.18)%(P<0.001),且PLA+PD组凋亡率明显低于PLA组,其差异统计学意义(P<0.001)。6、PLA+PD组相比PLA组Bcl-2/Bax明显升高,活性Caspase-3明显降低,差异均有统计学意义(P<0.001)。与空白对照组相较,PLA组活性P-ERK/ERK表达水平明显升高(P<0.001);PLA+PD组相比PLA组P-ERK/ERK明显降低(P<0.001)。结论:1、PLA可诱导气道上皮细胞凋亡;2、PLA可能通过激活Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡相关蛋白诱导气道上皮细胞凋亡;3、PLA可能通过调控ERK信号通路激活Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达诱导气道上皮细胞凋亡。