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目的：
再狭窄是影响经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)远期疗效的主要障碍。尽管血管成形术后的再狭窄机制目前尚不十分清楚，但有很多因素参与，包括血栓形成，平滑肌细胞增值和迁移，血管的弹性回缩，细胞外基质堆积引起的慢性重构。每一环节都是治疗的关键。尸体解剖报告证明再狭窄一定程度上是内膜增生引起的。平滑肌细胞增殖和迁移是动脉壁损伤和动脉粥样硬化的内膜形成的主要机制。中膜的平滑肌细胞有较低的分裂活性，在动脉壁损伤和动脉粥样硬化的早期阶段，各种生长因子刺激动脉平滑肌细胞由收缩型向合成型转变，并开始增殖，引起动脉内膜增厚。平滑肌细胞由收缩型向合成型转变在血管疾病的发生机制中起着关键作用。除生长因子的作用，平滑肌细胞增值和迁移还要求细胞周围的细胞外基质分解和再塑型，平滑肌细胞合成细胞外基质的重要成分包括胶原，弹力蛋白，蛋白聚糖。在血管介入治疗损伤中，细胞外基质的积聚和分解的失调是内膜增厚的主要原因，基质的再塑型要求蛋白水解酶的活动，其中基质金属蛋白酶(MMPs)起着关键作用。MMP—2，MMP—9活性在球囊损伤后第7天可达到高峰，与平滑肌细胞由中层向内膜迁移的时间过程相吻合。有研究显示，AP—1在球囊动脉损伤中活性明显增加。
A P—1主要由Jun和Fo s两大类蛋白质因子家族组成。Jun亚类中包括c—Jun、JunB、JunD；Fo s亚类中包括c—Fo s、Fo sB、F ra1、F ra2等。Jun亚类成员可以与任何AP—1家族因子结合形成同源或异源二聚体，或与另外一类含bZIP的转录激活因子(ATF)家族形成Jun—ATF2异源二聚体；而Fo s亚类只能和Jun亚类之间形成异源二聚体。AP—1的DNA特异性识别结合序列是只能被二聚体所介导。大量研究显示，AP—1同DNA亲和力(或高或低)位点的存在，可能是某一特定基因诱导A P—1结合的重要机制之一。因此，我们通过AP—1 ODN或反义c—Jun或反义c—Fos来降低AP—1总的DNA结合活性抑制平滑肌细胞增生，都取得明显效果。抑制平滑肌细胞增值的基因治疗作为PTCA术后减少狭窄的潜在方法。可是，体外用decoy ODN被核酸酶消化问题没有解决。StealthTMRNAi克服了这一难题。
目前，RNA干扰是最近发展起来的一种快速关闭基因的新方法。指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因沉默的现象，称为转录后基因沉默。由21—25个核苷酸组成的小片段干涉RNA是RNAi过程中直接起作用的分子，细胞表现出特定缺失的表型。RNAi对染色体DNA序列的复制和转录过程不产生任何影响。假设基因沉默能使AP—1复合物的活性减弱或丧失。我们设计了大鼠AP—1的siRNA，分别在c—Jun和c—Fos两个亚基设置靶点，采用LipofectamineTM2000作为转染试剂。把AP—lsiRNA转染入血管平滑肌细胞，通过抑制AP—1基因的表达，检测VSMCs的增殖、迁移及去分化是否改交，血清刺激对AP—1基因沉默的VSMCs的作用有无相应的变化。
方法：
1、采用组织块贴壁法行大鼠平滑肌细胞原代细胞培养，倒置显微镜下观察其形态，小鼠抗大鼠α—SM—actin单克隆抗体免疫荧光鉴定。
2、siRNAs由美国Invitregen公司设计合成3对StealthTMsiRNA，。同时合成与AP—1基因序列无关的siRNA作为阴性对照(negative control)。把特异性siRNA序列输入NCBI数据库进行比较(Blast)，与其他基因和EST序列没有同源性。实验设置未转染组、阴性siRNA组及阳性(AP—1+A、AP—1+B和AP—1+C)siRNA组。使用LipofectamineTM2000，转染AP—lsiRNA入平滑肌细胞。
3、用RT-PCR方法检测AP—1及下游基因的mRNA的表达，Westernblot方法检测c—Fos和c—Jun及AP—1下游基因的蛋白的表达，Trans—AM方法检测AP—1活性。
4、应用PCNA和MTT法检测VSMCs增殖的变化；流式细胞仪检测细胞周期；用Transwell和刮痕实验方法检测平滑肌细胞迁移情况，
5、用RT-PCR方法检测SM-α actin的mRNA的表达，Westernblot方法检测SM-α actin的蛋白的表达，免疫荧光共聚焦显微镜(Olympus FV—500)下观察平滑肌细胞分化情况。
6、用RT-PCR方法检测MMP—2、TIMP—2的mRNA的表达，Westernblot方法检测MMP—2和u-PA的蛋白的表达，明胶酶谱分析MMP—2和MMP—9活性。
结果：
1、阳性AP—1+B siRNA转染后的VSMCs的AP—1mRNA和e—Jun，c—Fos表达量显著降低，其余2个阳性转染组的AP—1表达量与未转染组及阴性siRNA转染组差异不显著，AP—1活性降低。AP—1+B siRNA的抑制效果最显著，故选择第AP—1+B siRNA作为阳性siRNA干预实验。
2、AP—1+B siRNA组的增殖活性明显低于未转染组和阴性siRNA干扰组。提示AP—1基因沉默后VSMC增殖能明显受到抑制，AP—1+B siRNA转染后VSMCs的PCNA阳性染色率较未转染组和阴性siRNA组均显著下降(P<0.05)。流式细胞仪检测细胞周期显示，AP—1+B siRNA干预后，被阻滞于G0/G1期的细胞增加，而S+G2/M期的细胞减少
3、在mRNA和蛋白表达效果上，AP—1+B siRNA转染组对c—Jun、c—Fos、e—myc、bFGF、ET—1、TGF-β抑制明显高于未转染组及阴性siRNA转染组。
4、为验证AP—1基因siRNA对大鼠平滑肌细胞分化标志蛋白SMα—actin表达的影响，用免疫荧光染色、RT-PCR和蛋白质印迹分析观察到与未转染组、阴性siRNA组相比，AP—1+B基因siRNA组的SMα—actin表达明显上调。细胞由原来的多边形转变为长梭形，环绕排列呈明显的管腔样生长，细胞增殖能力下降，平滑肌特异性分化标志蛋白SMα—actin．表达上调，说明细胞由合成表型逆转为分化表型．
5、Transwell趋化小室和刮伤试验结果显示：与正常平滑肌细胞相比，转染AP—1基因siRNA的平滑肌细胞明显减慢，迁移细胞数少。来转染组和阴性siRNA组之间细胞迁移速度无变化。AP—1+B基因siRNA阳性组与未转染组和阴性siRNA组在移行细胞数和移行距离上比较差异具有统计学意义(P<0.05)
6、用蛋白质印迹和RT-PCR分析发现AP—1基因siRNA阳性组抑制MMP—2的表达，TIMP—2mRNA变化不大。而未转染组和阴性siRNA组之间MMP—2表达变化不大。AP—1+BsiRNA阳性组与未转染组组和阴性siRNA组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。。未转染组和阴性siRNA组之间无统计学意义。AP—1+BsiRNA阳性组与未转染组比较，AP—1基因siRNA阳性组转染后平滑肌细胞中基质金属蛋自酶MMP—2、MMP—9活性明显降低。而阴性siRNA组和未转染组转染后平滑肌细胞中MMP—2、MMP—9活性变化不大。
结论：
1、AP—1+BsiRNA能明显抑制平滑肌细胞中AP—1的mRNA及c—Jun、c—Fos蛋白的表达，减弱AP—1的活性，并进一步抑制AP—1下游基因的表达。
2、AP—1+BsiRNA能明显抑制平滑肌细胞增值，迁移，促进平滑肌细胞由合成型向收缩型分化。
3、AP—1+BsiRNA能明显抑制平滑肌细胞MMP—2、MMP—9的表达，MMPs/TIMP比下降，减少细胞外基质沉积。