论文部分内容阅读
油菜是世界上主要的油料作物,我国是世界上最大的油菜生产国之一,2014年油菜种植面积为7.6×106 hm2,大豆种植面积为4.604×106 hm2,但是我国食用油的缺口很大,因此,提高油菜种子含油量仍然是育种家研究的重要课题。大量研究表明,在相同的遗传背景下,黄籽油菜的含油量一般高于褐籽、黑籽,且黄籽油菜具有种皮薄、油清澈透明、蛋白质含量高等优点。然而目前广泛栽培的甘蓝型油菜中却没有天然的纯合黄籽种质,吴旗黄芥黄籽性状多表现为纯黄且遗传稳定,遗传模式较为简单,是研究黄籽基因的理想材料。本研究构建吴旗黄芥（黄籽,SY）和关中褐芥（褐籽,GB）的BC9群体,以BC9群体中的黄籽株和褐籽株分别混池进行转录组测序,筛选显著差异表达基因（DEGs）,结合转录组BSR分析结果确定芥菜型油菜黄籽基因;另外,通过构建候选基因的超表达载体,釆用根癌农杆菌介导法转化模式植物拟南芥验证候选基因功能,研究结果为揭示芥菜型油菜黄籽性状形成的分子机制提供重要线索。主要研究结果如下:1.本研究对芥菜型油菜（SY×GB）BC9群体的黄、褐籽混池进行转录组测序,对所得数据进行过滤,重新组装后共得到42386条基因序列,其中将其与Nr数据库进行比对,注释到41018条基因序列,筛选得到245个显著差异表达的基因,其中有209个基因上调,36个基因下调,通过KEGG注释发现这些基因大部分注释到类黄酮生物合成途径、苯丙素合成途径和苯丙氨酸代谢途径。其中注释到类黄酮生物合成途径的显著差异表达基因有9个,分别为BjBAN、BjDFR、BjLDOX、BjTT5、BjC4H、BjTT8、BjTT4、BjPLA、BjF3H。2.采用BSR分析法,以白菜型油菜B.rapa（Chiifu-401）基因组为参考基因组,对黄、褐籽池进行SNP检测,比较黄、褐籽池SNP位点的基因型频率差异,结果在黄、褐池转录组数据间找到SNP 6825个,SNP在各染色体上的数量和各染色体大小成正比。计算等位基因频率差异（DeltaSNPIndex）,发现关联的SNP位点主要位于A9染色体上,因此我们将吴旗黄芥的黄籽基因定位于A09染色体,而之前筛选到的9个类黄酮生物合成途径显著差异表达基因中,其中BjDFR、Bj TT5、BjF3H、BjTT4、BjTT8在A09染色体上,所以我们初步确定这5个基因为吴旗黄芥黄籽性状的候选基因。3.为了进一步确定吴旗黄芥黄籽基因,我们以吴旗黄芥和关中褐芥两个亲本授粉后9,16,23,30,38,45天的种子为材料,分别检测这5个基因的相对表达量,并测定其类黄酮,花青素,黑色素和总酚含量,利用SPSS软件分析种子不同发育时期（授粉后9,16,23,30,38,45天）BjDFR、BjTT5、BjF3H、BjTT4、BjTT8基因相对表达量与类黄酮,花青素,黑色素和总酚含量的相关性,结果发现,BjTT5、Bj F3H的表达与关中褐芥和吴旗黄芥的种皮颜色相关指标存在显著相关关系,因此,我们进一步确定BjTT5、BjF3H可能是吴旗黄芥黄籽性状的候选基因。4.结合本课题组前期构建精密遗传图谱,将候选基因定位于A09染色体的23.30429.402Mb之间,发现BjF3H基因A09染色体的23.30429.402Mb之间,位于该区间内,因此我们推测BjF3H基因为控制吴旗黄芥黄籽性状的候选基因。5.利用同源克隆法,克隆BjF3H基因在亲本吴旗黄芥中的CDS序列,其序列全长为1077bp,编码358个氨基酸,采用双酶切法连接到pROK2载体上,构建超表达载体,采用花序侵染法侵染野生型拟南芥（褐籽）,目前已获得两株T2代籽粒颜色为黄色的阳性植株苗,证明BjF3H基因是控制芥菜型油菜黄籽性状的基因。