论文部分内容阅读
目的：构建并鉴定靶向大鼠TGF-β1基因的短发夹RNA(short hairpinRNA，shRNA)真核表达载体，制备负载重组质粒PGenesil-TGF-β1的壳聚糖纳米粒,并研究壳聚糖-pDNA纳米粒的结构特征和性能特点,为进一步探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。方法：1.根据RNA干扰序列设计原则和大鼠TGF-β1基因的mRNA序列挑选出两个大鼠TGF-β1基因的RNA干扰靶位，即TGF-β1基因的769-787nt(命名为TGF-β1-A)和1033-1051nt(命名为TGF-β1-B)，再按CACC+Sense+Loop+Antisense+终止信号+Sac I结构设计合成2对编码shRNA的特异性寡核苷酸片段,另选用通用阴性对照序列HK为阴性对照，将上述片段退火形成双链DNA后分别克隆进入线性化质粒载体PGenesil-1.1中，构建成含目的靶基因片段的shRNA真核表达载体PGenesil-TGF-β1-A、 PGenesil-TGF-β1-B及PGenesil-HK，并对重组质粒进行酶切鉴定及测序分析。2.采用复凝聚法制备壳聚糖-质粒PGenesil-TGF-β1微粒体，通过透射电镜测定壳聚糖-PGenesil-TGF-β1纳米粒的形态、粒径大小；采用凝胶电泳阻滞实验验证壳聚糖-pDNA复合物的形成并观察壳聚糖纳米粒与质粒的结合能力；DNaseI消化实验考察壳聚糖纳米粒保护质粒DNA抵抗核酸酶的能力；用全光谱分光光度计测定该复合物的包封率大小。结果：1.经酶切证实靶向大鼠TGF-β1基因的表达shRNA的目的基因片段分别被成功地克隆到质粒载体PGenesil-1.1中，测序结果进一步证明重组质粒的插入序列与设计的靶基因片段完全一致。2.采用复凝聚法制备的包裹重组质粒的壳聚糖-PGenesil-TGF-β1-A纳米粒及壳聚糖-PGenesil-TGF-β1-B纳米粒均呈球形，微粒直径在100-200nm之间，平均约(127.37±19.75)nm；凝胶电泳阻滞实验结果表明壳聚糖纳米粒能通过静电作用有效结合质粒，将其包裹在内，DNase I消化实验则示壳聚糖纳米粒能有效地保护质粒免受核酸酶的降解；制备的壳聚糖PGenesil-TGF-β1-A纳米粒和壳聚糖PGenesil-TGF-β1-B纳米粒的包封率分别为(94.38±0.45)%和(93.19±3.21)%，均大于90%。结论：成功构建出靶向大鼠TGF-β1基因的shRNA真核表达载体。用复凝聚法制得的壳聚糖-PGenesil-TGF-β1纳米粒直径在100-200nm之间，有较高的包封率，可有效凝聚pDNA，并能保护质粒免受核酸酶的降解，为后续研究抗肝纤维化的基因药物奠定了实验基础。