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目的:研究青蒿素的衍生物一青蒿琥酯(Artesunate,ARS)对淋巴细胞的抗肺癌细胞作用的影响,观察ARS作用后的淋巴细胞表面CD39和PD-1分子的表达量是否有变化,尤其杀伤性T淋巴细胞即细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)表面CD39和PD-1分子表达水平改变是否有统计学意义。将ARS作用诱导后的淋巴细胞与肺癌细胞共培养,观察分析肺癌细胞的增殖是否发生显著抑制或增加、肺癌细胞的凋亡水平是否出现明显增加或降低。方法:通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测不同浓度ARS对淋巴细胞的抑制率,得到ARS作用淋巴细胞的最适宜作用浓度;通过FCM检测正常人与肺癌患者体内杀伤性T淋巴细胞表面CD39和PD-1分子的表达含量百分比,对比ARS诱导与否这一因素对其表面分子表达水平的影响;通过FCM检测ARS诱导与否的淋巴细胞与肺癌细胞共培养后肺癌细胞的增殖与凋亡情况;通过FCM检测ARS诱导后的肺癌患者CTL胞内GrzB和PerF分子,以及Fas和FasL分子量。结果:1.根据流式所得数据绘制ARS处理PBMC细胞的时间依赖性和药物浓度依赖性的抑制率曲线,再根据药物浓度筛选实验确定ARS诱导浓度为20OμM。实验分为ARS诱导浓度为200μM的药物处理实验组和未经ARS诱导的对照组。2.根据流式结果图选择前向散射光和侧向散射光为横纵两坐标,将正常捐献者的淋巴细胞群设门,接着以CD3/CD8设门,选定CD3+CD8+T细胞群,以CD39/PD-1为轴,对比实验组与对照组的阳性表达百分率。所得数据通过双向配对T检验和独立T检验分析处理后,得到结果:正常捐献者的实验组CD39分子表达水平相对于对照组有显著增加,两组P值为0.002,结果有统计学意义;两组PD-1分子阳性表达百分率的P值为0.4107，结果无统计学意义。根据流式结果图选择前向散射光和侧向散射光为横纵两坐标,将肺癌患者的淋巴细胞群设门,以CD3/CD8双阳性区域设门,再以CD39/PD-1为轴,对比实验组与对照组的阳性表达百分率。所得数据通过双向配对T检验处理后,得到:肺癌患者的实验组CD39分子表达水平相对于对照组有显著增加,两组P值为0.0004,结果有统计学意义;PD-1分子表达水平相对于对照组有明显升高,两组PD-1分子阳性表达率P值为0.0002，结果有统计学意义。对比辅助性T细胞(Th细胞),即CD3+CD4+T细胞群的荷药前后变化,P值均无统计学意义,提示ARS对Th细胞表面CD39和PD-1分子的表达无显著影响。在此基础上,将实验标本的临床流行病学等信息根据不同条件(如性别、年龄、肺癌类型、病史、治疗史等)分类分析后,全文实验结果显示,影响ARS诱导CTLCD39分子的因素可能为放疗、单核细胞绝对值计数;影响ARS诱导CTLPD-1分子的因素可能为肺癌类型、放疗、性别与单核细胞绝对值计数,P值均有统计学意义。3.根据共培养后上机检测的流式结果图显示,实验组的肺癌细胞CFSE强阳性细胞数量显著高于对照组、提示ARS诱导处理后的CTL其抗肿瘤增殖的活性被显著抑制,而ARS实现这一功能的路径可能是经由增加CTL表面的CD39分子与PD-1分子的表达量铺垫完成;检测结果同时显示,共培养后的肺癌细胞其Annexin V阳性细胞表达百分率高于对照组,P值分别为0.0123、0.0182,均有统计学意义,提示经ARS诱导后肺癌患者CTL可促进肿瘤细胞的凋亡，其机制可能包括ARS影响CTL表面的CD39分子与PD-1分子的表达水平。4.在探究CTL诱导肺癌细胞凋亡的实验结果显示,ARS诱导后的肺癌患者CTL内GrzB的表达水平显著上调且有统计学意义,P值为0.0302;而PerF、Fas和FasL分子的表达均未受明显影响,P值分别为0.1549、0.3934和0.9273.结论:本研究发现ARS能通过作用细胞毒性T淋巴细胞表面CD39和PD-1分子,使其表达量发生显著上调;对流行病学资料的分析结果显示,影响ARS诱导CTL细胞表面CD39分子和PD-1分子表达量的因素可能分别为放疗史、单核细胞绝对值计数与肺癌类型、放疗、性别与单核细胞绝对值计数,揭示了 ARS更适用于诱导治疗的肺癌患者类型。ARS诱导后的淋巴细胞与肺癌细胞共培养实验中发现肺癌细胞的增殖受显著抑制,同时肺癌细胞的凋亡率明显增加,证明ARS可能是通过改变CTL表面CD39分子和或PD-1分子的水平间接诱导肺癌细胞的凋亡,同时阻滞了肺癌细胞的增殖。机制的探究实验证明,ARS通过诱导肺癌患者CTL胞内GrzB的高表达诱导肺癌细胞凋亡。图49表2参61