β-榄香烯通过PI3K/Akt信号传导通路抑制血管内皮细胞增殖的研究

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背景:   β-榄香烯(β-elemene)是从中药温郁金根茎中提取的抗癌有效成分,是一种新型抗癌药,其对肝肾功能无损害、无骨髓抑制、抗癌谱广。目前已有研究证实β-榄香烯对喉癌、食管癌、胃癌、结肠癌、舌癌、宫颈癌、肺癌、卵巢癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、肝癌等有治疗作用。β-榄香烯抗肿瘤作用机理包括以下方面:β-榄香烯可直接杀伤肿瘤细胞。β-榄香烯通过影响肿瘤细胞的生长周期,抑制肿瘤细胞的DNA、RNA合成而抑制肿瘤细胞的生长。榄香烯可通过抑制端粒酶活性诱导肿瘤细胞凋亡。榄香烯可使癌基因表达降低,抑癌基因表达增强。β-榄香烯可逆转肿瘤细胞耐药,抗肿瘤细胞浸润及迁移,并对放化疗有一定增敏作用。   还有研究表明,β-榄香烯可抑制肿瘤血管生成。榄香烯可通过与eLF家族成员作用引起相关蛋白血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)表达下降,抑制肿瘤血管生成,同时能够降低VEGF-C、VEGFR-3的表达水平,从而起到抑制肿瘤血管、淋巴管转移的作用。本实验室的前期研究表明,榄香烯能抑制血管内皮细胞的增殖活性,诱导人脐静脉内皮细胞凋亡。   PI3K/Akt通路是细胞的重要信号转导通路,其独立于其它生长因子信号传导系统,通过影响凋亡相关蛋白和细胞周期调节蛋白等的活化,参与调控细胞的代谢、生长和凋亡。本文通过研究β-榄香烯作用下血管内皮细胞PI3K/Akt蛋白的改变,进一步探讨β-榄香烯对血管内皮细胞作用的机制及路径。   材料与方法:   一、细胞培养   人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)用含10%灭活胎牛血清的1640培养基培养,37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱孵育,每日换液一次,2日传代一次,用0.25%的胰蛋白酶消化细胞。   二、肿瘤上清液的制备   培养胃癌823细胞,当其融合达80%时换以无血清1640培养基,继续培养24小时,离心收集上清液,将其与1640培养液以1:4的比例混匀备用。   三、MTT法检测β-榄香烯作用对HUVECs增殖的影响   不同浓度β-榄香烯作用组:-HUVECs中分别加入含2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/m1β-榄香烯的作用液孵育24小时,不加β-榄香烯组为对照组。   不同时间β-榄香烯作用组:8 u g/mlβ-榄香烯作用于HUVECs0,24,48,72小时。   将HUVECs细胞接种于96孔板中,分别加入不同浓度β-榄香烯,或β-榄香烯作用不同时间后,加入MTT溶液4小时,孔内形成紫色结晶,再加入DMSO溶液终止反应,振荡混匀,置于酶标仪上检测光吸收值(OD),测定波长为490nm。   四、Western b lot检测β-榄香烯作用对HUVECs PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响   采用Western Blot检测不同浓度β-榄香烯(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml)作用6小时后,HUVECs中PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的变化。   五、统计学处理   各组实验重复三次。以Bioimagining System灰度测量系统测量westen blot条带灰度值,应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析和处理,统计方法采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。   实验结果:   一、β-榄香烯对HUVECs增殖率的影响   MTT法检测,除2μg/mlβ-榄香烯作用24小时,对HUVECs的增殖具有促进作用外,其余浓度β-榄香烯对HUVECs的增殖均有明显的抑制作用,并呈剂量和时间依赖性。   二、β-榄香烯对肿瘤细胞上清液诱导的HUVECs PI3K、Akt及p-Akt蛋白表达的影响   肿瘤上清液刺激可使HUVECs Akt及p-Akt蛋白表达增加。β-榄香烯作用组HUVECs中PI3K蛋白表达增加,对Akt蛋白表达无明显影响;HUVECs中p-Akt蛋白表达随着β-榄香烯浓度升高而逐渐减少。   结论:   β-榄香烯可抑制HUVECs的增殖,其作用可能是通过抑制PI3K/Akt通路中磷酸化Akt的蛋白表达实现的。
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