1.在体研究淀粉样蛋白膜内片段(intramembranous fragments ofamyloid-β，IF-Aβ)疫苗对淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)转基因(transgenic，Tg)小鼠的作用特性； 2.体外研究IF-Aβ及免疫血清的生物学特性； 3.初步研究以壳聚糖纳米颗粒为载体的IF-Aβ的免疫原性和血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)通透性。 方法： 1.在体研究淀粉样蛋白膜内片段IF-Aβ疫苗对APPTg小鼠的作用特性。 (1)动物分组和免疫程序：28只6月龄APPTg C57BL/6J小鼠，体重30g±2g。按雌雄对半随机分为4组：对照组、IF50组、IF100组和Aβ42组。分别用PBS、keyhole limpethemocyanin-IF-Aβ(KLH-IF-Aβ)(IF-Aβ，50μg/只)、KLH-IF-Aβ(IF-Aβ，100μg/只)和keyhole limpet hemocyanin-Aβ42(KLH-Aβ42)(Aβ42，100μg/只)混合弗氏佐剂腹腔注射免疫小鼠，共4次2.5月。 (2)免疫程序结束后，用酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)检测血清和大脑中可溶性Aβ42、血清和脑组织中抗Aβ42 IgG、IgM和脾细胞释放γ-干扰素(γ-interferon，γ-IFN)。 (3)水迷宫和Y迷宫检测APP Tg小鼠经过免疫治疗后认知功能变化情况； (4)刚果红染色和免疫组化检测模型鼠大脑老年斑的变化； (5)以CD3、CD4、CD8和CD19为标记评价免疫APP Tg小鼠大脑淋巴细胞浸润情况； (6)HE染色评价模型鼠通过免疫治疗后海马组织和细胞状况； (7)透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察免疫模型鼠后海马细胞及组织的超微结构； 2.体外研究IF-Aβ及免疫血清的生物特性 (1)硫磺素T检测IF-Aβ的成纤维性能； (2)硫磺素T检测IF-Aβ及其抗血清对Aβ42成纤维性的抑制作用； (3)原代培养昆明小鼠大脑皮层神经元细胞，用MTT比色法检测IF-Aβ及免疫血清对细胞的保护作用； (4)通过钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM负载细胞，荧光双波长分光光度计检测细胞内钙离子浓度的变化，研究IF-Aβ及免疫血清对体外培养神经元的影响； (5)原代培养昆明小鼠大脑皮层神经元细胞，分别从基因水平和蛋白水平研究IF-Aβ对神经元表达APP mRNA和APP的影响。 3.初步研究以壳聚糖纳米颗粒为载体的IF-Aβ的免疫原性和BBB通透性。 (1)通过磁力搅拌方法，制作壳聚糖纳米载体； (2)以TEM和光子相关光谱仪(photon correlation spectroscopy，PCS)检测粒径大小及形状； (3)在37℃作用1h，纳米颗粒与IF-Aβ发生物理吸附和化学偶联反应。HPLC检测其偶联效率； (4)以IF-Aβ纳米颗粒为抗原，检测IF-Aβ纳米颗粒的免疫原性； (5)荧光分光光度计和荧光显微镜检测其血脑屏障通透性。 结果： 1.IF-Aβ疫苗对APP Tg小鼠的作用特性研究。 (1)ELISA结果显示：IF-Aβ疫苗对APP转基因小鼠具有良好的体液和细胞免疫原性。 (2)IF-Aβ的免疫原性在剂量是100μg/只小鼠时高于50μg/只小鼠时； (3)水迷宫和Y迷宫检测显示：免疫治疗后，IF50组小鼠的认知功能加强，而IF100组小鼠的认知功能下降。 (4)经过2.5月的IF-Aβ疫苗治疗，对照组小鼠大脑皮层和海马区老年斑无明显变化；IF50组小鼠大脑皮层和海马区老年斑有所减少；Aβ42和IF100组小鼠大脑皮层和海马区老年斑明显减少。 (5)对照组和IF50组小鼠的大脑皮层和海马区无明显的淋巴细胞浸润；Aβ42组小鼠大脑皮层和海马区出现淋巴细胞浸润；IF100组小鼠的大脑皮层和海马区出现明显的淋巴细胞浸润。 (6)HE染色结果显示IF100组小鼠海马组织出现细胞结构模糊、排列不齐现象。 (7)透射电镜显示：与对照组相比，IF50组小鼠的大脑海马区神经细胞和胶质细胞超微结构明显改善；Aβ42组和IF100组小鼠的大脑海马区神经细胞和胶质细胞坏死和凋亡现象加重。 (8)经过2.5月的免疫治疗后，各免疫组小鼠海马组织水溶性Aβ42下降，而血清Aβ42含量上升。尤以IF50组和IF100组有显著统计学意义。 (9)与Aβ42比较，在相同摩尔质量的应用剂量下，IF-Aβ具有更安全有效的特点； (10)综合所有检测结果，IF-Aβ在50μg/只小鼠的免疫剂量下，大脑内无炎症反应，且认知功能明显提高。故IF-Aβ在50μg/只小鼠的剂量下，对APP Tg C57BL/6J小鼠具有治疗效果。 2.IF-Aβ及免疫血清的生物特性的体外研究 (1)硫磺素T检测IF-Aβ没有成纤维性； (2)IF-Aβ及免疫血清可以抑制Aβ42的成纤维性； (3)MTT比色法结果显示，IF-Aβ没有任何毒性作用。IF-Aβ、IF-Aβ抗血清和Aβ42抗血清均可以对抗Aβ42的毒性作用。同时，随着细胞活力的改变，细胞内钙离子浓度随之改变。 (4)10μmol/L IF-Aβ可以明显抑制体外培养神经元APP和APPmRNA的表达，而对照组和10μmol/L IFAβ+10μmol/L Aβ42没有此效果。 3.以壳聚糖纳米颗粒为载体的IF-Aβ的免疫原性和BBB通透性研究。 (1)通过磁力搅拌方法制作的壳聚糖纳米颗粒呈近似圆形，分散良好，粒径大小在15.23±10.97 nm之间； (2)纳米颗粒和IF-Aβ的偶联效率为78.4％； (3)IF-Aβ具有良好的免疫原性； (4)以壳聚糖纳米颗粒为载体的IF-Aβ的血脑屏障通透率为80.6％，与对照组(20.6％)相比，具有明显差异性。 结论： 1.IF-Aβ在50μg/只小鼠的免疫剂量下，具有良好的免疫原性，大脑内无炎症反应，且认知功能明显提高。故IF-Aβ在50μg/只小鼠的剂量下，对APP Tg C57BL/6J小鼠具有治疗效果； 2.IF-Aβ及其免疫血清对体外培养神经元有保护作用，其保护作用可能与其可以抑制Aβ42聚集有关； 3.10μmol/L IF-Aβ可以明显抑制体外培养神经元APPmRNA和APP的表达； 4.IF-Aβ纳米颗粒具有良好的免疫原性； 5.IF-Aβ纳米颗粒具有良好的血脑屏障通透性.