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第一部分去除PKA磷酸化位点对Mfn2基因调控细胞增殖和凋亡功能的影响1.目的研究大鼠线粒体融合素基因2(Mitofusin 2, Mfn2)在去除蛋白激酶A (Protein kinaseA, PKA)磷酸化位点后对大鼠血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖和凋亡的影响及相关的信号通路。2.方法利用携带去除PKA磷酸化位点的Mfn2重组腺病毒[Adv-Mfn2-PKA(△)]和携带Mfn2的重组腺病毒(Adv-Mfn2)感染大鼠VSMCs。激光共聚焦显微镜观察其细胞内定位；荧光显微镜观察细胞形态变化；四甲基偶氮唑盐(MTT)法比较其对细胞增殖的影响；细胞凋亡ELISA分析其对细胞凋亡的影响；Western blot法分析Mfn2-PKA(△)、Mfn2、磷酸化ERK1／2(p-ERKl／2)和磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表达变化。3.结果外源基因转染后表达特异性蛋白产物；Mfn2-PKA(△)主要分布于线粒体上,与Mfn2相同；Mfn2-PKA(△)抑制VSMCs增殖、诱导VSMCs凋亡的作用较Mfn2显著减弱(P<0.01),与对照组无显著差异；Mfn2-PKA(△)较Mfn2组p-ERK1／2表达显著升高(P<0.01),p-Akt表达也显著升高(P<0.01),与对照组无明显差异。4.结论去除PKA磷酸化位点不影响Mfn2在线粒体上的定位,但其调节VSMCs增殖和凋亡的作用消失,对ERK1／2和Akt信号通路也无抑制作用。表明PKA磷酸化位点对Mfn2调节VSMCs增殖和凋亡的功能有重要影响。第二部分Mfn2磷酸化位点突变体抑制细胞增殖作用的差异1.目的研究大鼠线粒体融合素2基因(Mitofusin2, Mfn2)蛋白激酶A (Protein kinase A,PKA)磷酸化位点的状态对大鼠VSMCs增殖的影响及其相关的信号通路。2.方法利用携带PKA磷酸化位点突变的Mfn2重组腺病毒(Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2-S442D)和携带Mfn2的重组腺病毒(Adv-Mfn2),感染大鼠VSMCs。激光共聚焦法分析Mfn2及其突变体对线粒体形态的影响。细胞计数法、水溶性四甲基偶氮唑盐(WST-1)法比较其对细胞增殖的影响；流式细胞术比较各组细胞周期的变化；Western blot法分析各组Mfn2、磷酸化Raf-1(p-Raf-1)、磷酸化ERK1／2(p-ERKl／2)蛋白表达变化。建立大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄模型,局部血管转染Mfn2及突变体基因,HE染色观察颈动脉内膜增殖程度,免疫组化染色观察增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平。3.结果外源基因转染后表达特异性蛋白产物,Mfn2及其突变体均促进线粒体融合并聚集于核周。细胞实验,Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2抑制细胞增殖作用较对照组显著增强(P<0.01),停滞于G0／G1期细胞比例显著增加(P<0.01)；p-Raf-1和p-ERK1／2表达水平显著降低(P<0.01),且Adv-Mfn2-S442A作用更明显(P<0.01),而Adv-Mfn2-S442D组较对照组无显著差异。动物实验,Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2组大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增殖较对照组显著减弱(P<0.01),PCNA表达水平显著减弱(P<0.01),且Adv-Mfn2-S442A作用更明显(P<0.01),而Adv-Mfn2-S442D组较对照组无显著差异。4.结论去磷酸化的Mfn2通过ERK1／2信号通路抑制VSMCs增殖的作用较Mfn2更明显；而磷酸化的Mfn2无显著作用。PKA磷酸化位点的状态对Mfn2调节VSMCs增殖有重要影响,并独立于Mfn2促进线粒体融合的作用。第三部分Mfn2磷酸化位点突变体诱导细胞凋亡作用的差异1.目的研究大鼠线粒体融合素2基因(Mitofusin2, Mfn2)蛋白激酶A (Protein kinase A,PKA)磷酸化位点的状态对大鼠VSMCs凋亡的影响及其相关的信号通路。2.方法利用携带PKA磷酸化位点突变的Mfn2重组腺病毒(Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2-S442D)和携带Mfn2的重组腺病毒(Adv-Mfn2),感染大鼠VSMCs。流式细胞术比较各组细胞凋亡率的变化；JC-1染色法检测线粒体膜电位变化；Westernblot法分析各组Mfn2、磷酸化Akt(p-Akt)和活性半胱天冬酶9(cleaved caspase-9)蛋白表达变化。3.结果外源基因转染后表达特异性蛋白产物。Adv-Mfn2-S442A和Adv-Mfn2诱导细胞凋亡的作用较对照组显著增强(P<0.01),线粒体膜电位显著降低(P<0.01),p-Akt表达水平显著降低(P<0.01),cleaved caspase-9表达水平显著增高(P<0.01),且Adv-Mfn2-S442A作用更明显(P<0.01),而Adv-Mfn2-S442D组较对照组无显著差异。4.结论去磷酸化的Mfn2通过Akt信号通路诱导VSMCs凋亡的作用较Mfn2更明显；而磷酸化的Mfn2无显著作用,PKA磷酸化位点的状态对Mfn2调节VSMCs凋亡有重要影响。