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基因组定点编辑技术是生命科学领域的前沿技术,已被应用于多种生物的基因修饰工作中。蜜蜂基因组学研究尚处于起步阶段,这项技术在蜜蜂发育生物学中应用,可成为定向修饰蜜蜂生物活体遗传信息的一种手段。本研究以意大利蜜蜂早龄胚胎为实验材料,选取胚胎发育中的几个基因,构建了TALEN和CRISPR/Cas9打靶载体,利用显微注射技术将其导入蜜蜂早龄胚胎中,用以进行基因定点敲除和诱导突变研究,取得的主要研究结果如下：1.由于蜂卵采集区域与实验室距离较远(16Kmm左右),为保证蜂卵的存活率,设计了四种运输器皿的筛选实验,以移取的产后5-6h蜂卵的经过巢外运送后最大孵化率为依据选择。结果表明：卤代烃油(halocarbon oil)透气且带有部分溶氧,可为蜂卵保湿并保证其呼吸,将这种油涂布在巢础上用保温盒运送的蜂卵平均孵化率最高,达到了53.64%；将产下的蜂卵放置在35℃恒温水浴锅中培养,直到90-100h后才会孵化为幼虫。2.为减少显微注射对蜂卵的伤害,探索了在最适宜的器皿中进行显微注射的各项参数。结果表明：割除置于培养皿中巢础中间的部分巢础条,在割去部位涂布适量卤代烃油,由此制成的注射皿显微注射后蜂卵的孵化率较高；选择蜂卵的腹背部与尾部的中间部位作为注射点可提高注射效率；注射至卵黄或周质中对蜂卵的孵化率影响不明显,但注射至周质中不易堵住针头且创伤较小,因此可提高注射效率；倾斜方向进针注射容易扎入,且拔针后卵内物质外溢较少,可提高孵化率；注射0-2nl的外源物质后蜂卵的孵化率较为稳定,注射量增大孵化率降低,但注射量过小会降低外源物质的作用效率；经过显微注射后的蜂卵在35℃恒温水浴锅中的发育历期会延长至100-120h。根据以上注射参数进行石蜡油的注射实验,培养100h左右,发现23%的蜂卵孵化为幼虫,在显微镜下观察到注入的石蜡油油滴在一定区域内随蜂卵的蠕动而移动；注射pEGFP-N1质粒36-48h后可观察到点状荧光表达,但蜂卵存活率低,60h后蜂卵虚弱死亡3.为了便于进行基因敲除后的检测工作,对快速提取蜜蜂基因组的方法进行了探讨。在95℃条件下,采用50mM的NaOH溶液对蜜蜂卵、幼虫或成虫的组织研磨物进行充分裂解,冷却至常温后,加入pH 8.0的Tris-HCl进行分离提取基因组DNA。该方法提取的蜜蜂基因组DNA可作为PCR扩增的模板,产物可以被限制性内切酶完全酶切,可用于片段长度低于1500bp的蜜蜂基础生物学实验研究。4.对发育基因En、Prd、Tll各设计了一对TALEN靶位点,采用单元组合法合成TALEN左右臂后,进行体外转录以合成各个基因TALEN的mRNA,测定浓度后将基因TALEN左右两臂的mRNA同时注入到产后5-6h的蜜蜂胚胎中,在35℃恒温条件下培养48-60h,分别提取它们的基因组DNA进行限制性内切酶酶切检测,结果表明：Tll基因部分扩增片段存在突变可能,TA克隆后进行测序发现存在单碱基突变,说明TALEN有望诱导蜜蜂相关基因发生突变。5.对发育基因Dfd、Eve、Otd-1、Prd、Tll进行了CRISPR/Cas9靶位点设计,主位点区域符合T7体外转录启动子的要求后,确定靶位点序列并制备出gRNA模板,进行体外转录回收Cas9/gRNA,测定浓度后将其与Cas9 mRNA同时注入到产后5-6h的蜜蜂胚胎中,在35℃恒温条件下培养48-60h,分别提取它们的基因组DNA进行限制性内切酶酶切检测,通过对突变型基因片段的TA克隆产物测序发现Otd-1基因在该技术介导下产生了突变,表明该技术有望在蜜蜂中进行基因编辑。