儿茶酚胺敏感性多形室速(catecholaminergic polymorphic ventriculartachycardia，CPVT)是一种主要见于青少年的遗传性心律失常。CPVT患者平时没有症状，但在剧烈运动或情绪受激等儿茶酚胺激动条件下，则可能突发室性心动过速，并引起头晕、昏厥甚至猝死。CPVT是一种高致死性心脏疾病，如不进行治疗，80％的CPVT患者会在40岁之前出现症状，其总体致死率达30％到50％。已知多数CPVT相关突变都定位于肌质网钙释放通道(ryanodine receptor type2，RyR2)。在心肌兴奋收缩耦联过程中，RyR2通道的钙释放活动受到L型钙通道(L-type calcium channel，LCC)的局部控制。在心肌收缩期，RyR2通道被LCC钙内流激活并产生钙释放;在心肌舒张期，RyR2通道保持关闭状态，以维持胞浆的低钙环境。交感神经兴奋时，儿茶酚胺激动心肌β肾上腺素受体(β-adrenergicreceptor,βAR)，提高心肌兴奋收缩耦联效率。但在CPVT心脏中，βAR激动造成心肌舒张期RyR2通道自发钙释放活动异常活跃，主要表现为钙波发生频率增加。钙波可激活钠钙交换体，引发迟后去极化（delayed afterpotential, DAD），提高心律失常风险。CPVT相关突变如何影响RyR2通道的钙释放，以及突变如何与βAR激动协同增强RyR2的自发钙释放，目前仍是悬而未决的热点问题。我们采用携带CPVT相关突变RyR2-R2474S的基因敲入小鼠作为实验动物模型，灵活利用电生理技术和激光共聚焦钙成像技术，从细胞钙动态入手对以上问题展开探索，期望揭示RyR2功能失常引起CPVT的机制。　　心肌细胞RyR2钙释放活动存在不应期，即钙释放后短时间再发生钙释放的概率和强度有所下降。这是心肌维持舒张期低钙环境的机制之一。βAR激动后RyR2突变的心肌细胞舒张期自发钙波增加，可能是由于突变和βAR激动共同影响了RyR2钙释放活动的不应期。为了验证这一假说，我们以50 nM ryanodine诱使RyR2通道重复发放钙火花，通过测量前后相继的一对钙火花的幅度的比值及其间隔时间，研究RyR2-R2474S突变和βAR激动对RyR2自发钙释放不应期的影响。结果显示，RyR2-R2474S突变和βAR信号通路的激活都加快了钙火花幅度的恢复，并缩短了自发钙火花的间隔时间，并且二者的作用效果可以叠加。这一结果说明，在RyR2-R2474S突变或βAR激动后的心肌细胞中，钙释放位点在一次钙释放后，不仅短时间内再次发生自发钙释放的概率有所提高，而且钙释放强度也有所增加。小鼠心脏在βAR激动后的心率可高达700-800次/分钟，这意味着可诱发DAD的RyR2自发钙释放发生在上次钙释放之后几十毫秒内。结果显示，在这个关键的时间窗口内，RyR2-R2474S突变和βAR激动对RyR2钙释放不应期的叠加作用转变为协同作用，即单独突变和βAR激动都不增加钙火花的重复发放概率，但二者同时存在则显著提高了钙火花重复发放的可能性。　　胞浆钙离子浓度是RyR2通道最关键的生理调控因素，RyR2自发钙释放不应期的缩短可能是由于RyR2通道对胞浆钙离子敏感性的增加。我们利用LCC与RyR2的耦联关系，使用松钳技术将局部膜片去极化触发LCC开放，同时使用激光共聚焦钙成像技术记录LCC所触发的钙火花信号，研究RyR2通道对LCC钙内流所引起的胞浆钙离子信号的反应。通过统计LCC钙内流所产生的钙小星信号和RyR2开放产生的钙火花信号之间耦联的潜伏期，我们发现RyR2-R2474S突变和βAR激动都显著提高了LCC触发RyR2的耦联速率，且其作用效果可以叠加。这种耦联速率的提高主要反映了RyR2对LCC钙内流敏感性的增加。RyR2-R2474S突变降低了钙火花的幅度，而βAR激动则提高了钙火花幅度，这和肌质网钙储量的变化是一致的。另外，通过分析RyR2的钙释放电流，我们发现RyR2的钙释放强度呈现量子特性，即其释放强度是单位量子钙释放的整数倍。由于RyR2通道存在耦联门控行为，我们推测单位量子钙释放来自单个RyR2通道的开放，而多量子释放事件来自多个RyR2通道的同步开放。RyR2-R2474S突变和βAR激动都部分地破坏了量子释放性质，原因可能在其促使RyR2通道产生亚电导开放。　　松钳实验所产生的LCC钙内流信号高于兴奋收缩耦联过程中的LCC钙内流信号，也高于钙波传播过程中由钙波前沿扩散至待募集位点的钙信号。为了说明RyR2通道对生理钙信号尤其是微弱钙信号的响应情况，我们通过全细胞膜片钳方法使细胞产生不同幅度的LCC钙内流并触发RyR2钙释放活动。结果显示，RyR2-R2474S突变不影响LCC钙电流，但显著增大了RyR2的钙释放幅度，提示突变增加了RyR2对胞浆钙离子的敏感性。βAR激动提高了LCC钙电流，也增强了RyR2钙释放，但通过将LCC钙电流换算成钙内流引起的胞浆钙浓度变化，我们发现βAR激动也提高了RyR2对胞浆钙离子的敏感性。RyR2-R2474S突变和βAR激动对RyR2敏感性的影响可以叠加。对于130-140nM的微弱胞浆钙信号，βAR激动后突变细胞RyR2的敏感性显著提高，而野生型则无变化。这说明对于微弱的胞浆钙信号，突变和βAR激动对RyR2敏感性整体上可叠加的影响就表现为协同作用。这也提示我们，RyR2对微弱胞浆钙信号敏感性的增加，可能是CPVT发生的关键机制。　　接下来我们使用了两种FKBP12.6缺失的CPVT细胞模型，验证RyR2对胞浆钙信号敏感性的增加是否是CPVT的普遍特点。FKBP12.6是重要的RyR2功能调节蛋白，使用FK506或rapamycin处理心肌细胞可使FKBP12.6与RyR2解离，并提高钙波的发生率。我们利用松钳实验发现，FK506或rapamycin处理显著提高了大鼠心肌细胞LCC-RyR2的耦联速率，意味着RyR2对胞浆钙信号的敏感性有所增加。在全细胞膜片钳下将细胞膜电位去极化至-40 mV，可诱发离散的钙火花而不引发钙瞬变，单位钙电流触发钙火花的效率反映了RyR2对LCC钙内流的敏感性。FKBP12.6敲除小鼠的钙火花触发效率显著高于野生型小鼠。对野生型小鼠使用FK506或rapamycin处理也可显著提高钙火花触发效率，而对FKBP12.6敲除小鼠进行同样处理却不能进一步提高钙火花触发效率。药物处理和FKBP12.6基因敲除两方面的证据都表明，FKBP12.6缺失可显著提高RyR2对胞浆钙离子的敏感性。这些结果提示，RyR2对胞浆钙离子敏感性的提高可能是CPVT模型的共同机制。　　综上所述，RyR2突变和βAR激动都提高了RyR2对胞浆钙离子的敏感性，但都不足以使RyR2被相邻钙释放位点钙火花扩散引起的局部钙浓度变化所激活。而携带RyR2突变的细胞在βAR激动条件后，突变与βAR激动的作用效果相叠加，使RyR2对微弱胞浆钙信号的敏感性显著增强，且βAR激动引起肌质网钙储量增加，造成钙释放位点之间钙致钙释放的几率显著升高，从而导致钙波的发生。这一结论不仅揭示了CPVT心肌细胞在舒张期易于发生钙波的机制，而且对理解心肌兴奋收缩耦联局部控制机制亦有启发。