论文部分内容阅读
目的：1．研究胎儿不同发育阶段皮肤组织的形态结构及抗原表达，并检测汗腺发育中皮肤组织内某些基因转录表达水平的动态变化，探讨皮肤附属器汗腺的发生和发育规律，进而寻找在汗腺发育中起重要作用的相关基因；2．研究汗腺相关基因与骨髓间充质干细胞的应用对汗腺再生修复的影响，探讨基因和干细胞治疗在汗腺组织再生修复方面的可行性。方法：1．采用HE染色和免疫组化方法观察胎龄为10～36w人胎儿皮肤组织的结构和特征，采用RT-PCR和western blotting等方法分析人类胎儿皮肤及汗腺附属器生理发育过程中的相关基因表达及其规律。2．从人胎儿成纤维细胞中克隆人汗腺相关基因的DNA片段，构建真核表达质粒，采用裸基因注射和体外转染大鼠MSCs后局部移植的方式处理裸鼠烫伤部位，RT-PCR和western blotting检测MSCs导入基因表达水平的变化，采用常规和免疫组化染色观察汗腺组织再生修复情况，结合碘-淀粉发汗试验检测汗腺功能以判定治疗效果。结果：1．不同发育阶段胎儿皮肤组织结构呈现规律性的演进，光镜下观察汗腺组织的发生发育过程大致分为三个阶段：胎儿发育第12～16w，为汗腺发育启动期，胎儿表皮基底层细胞分裂增殖，出现局灶增殖相间分布细胞团，进而向真皮凹陷生长形成表皮嵴；表皮嵴基底部及部分区域的基底层细胞增生活跃，相互聚集形成皮肤附件包括汗腺的原基，发育至16w左右的胎儿皮肤可观察到汗腺原基部细胞呈条索状向真皮深层生长。胎儿发育17w至24w，为汗腺发育成形期，汗腺发生发育活动在此期到达高峰，皮肤基底层细胞不断发生新汗腺原基的活动在此期到达高峰；汗腺原基细胞条索继续向真皮深部延伸生长，末端膨大形成蟠管，连接蟠管和原基的中段形成皮内导管原基；20w时细胞条索内部部分细胞退化变性形成腔隙，之后腔隙彼此沟通形成贯通管腔；23～24w，表皮基底层细胞形成汗腺原基活动减弱，汗腺数量趋于稳定，组织结构初步形成。胎儿发育25～33w，为汗腺发育成熟期，汗腺数量稳定，结构进一步完善。2．免疫组化结果显示汗腺的形成过程中表型变化的特殊规律：β1整合素在汗腺原基细胞表达阴性，汗腺蟠管形成后在蟠管细胞表达阳性；CK7在汗腺结构发生早期不表达，汗腺发育形成细胞索后在分泌部和皮内导管部原基细胞表达且表达部位呈现规律性下移；CK14在皮肤基底层和汗腺导管部连续表达；CK8／18在形成分泌部后表达；CK19和CEA在汗腺形成早期就有强表达并持续至汗腺成熟后。3．RT-PCR和western blotting检测结果显示皮肤中FGF10和EDA的转录表达在汗腺发育三阶段呈现规律性的上升-平台-下降趋势，与汗腺发生发育的变化规律基本相符；FGF7无上述显著性的变化。4．从胎儿成纤维细胞获取FGF10和EDA-A1基因片段，构建真核表达质粒，经酶切图谱鉴定和测序证实构建成功；将真核质粒注射到烫伤裸鼠足掌，可以促进汗腺的再生，发汗试验强阳性。5．采用构建的质粒以脂质体为载体体外转染大鼠MSCs，免疫细胞化学染色和western blotting检测结果显示目的基因表达显著增强，并分泌相应蛋白。将BrdU标记后的基因转染MSCs局部移植到裸鼠烫伤部位，显示部分移植的MSCs能够参与汗腺组织结构的再生修复并表达汗腺细胞表型。结论：1．皮肤汗腺的发育形成有明显的阶段性规律，其发育相关基因的转录表达水平的变化与之基本相符。2．局部直接导入汗腺发育相关基因对汗腺损伤后再生修复有促进作用，而基因修饰的骨髓间充质干细胞亦可有效参与汗腺修复，基因治疗联合干细胞治疗技术将为烧伤患者皮肤功能重建乃至完全再生带来新的希望。