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第一章氟非尼酮对肾小管上皮细胞炎症反应的影响及作用机制研究研究背景：肾纤维化是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾病的共同通路和主要病理基础。无论何种病因导致的慢性肾脏疾病,随着慢性肾脏疾病的进展往往会导致广泛的组织纤维化、肾实质完全破坏和肾功能衰竭。因此,攻克肾脏纤维化一直是慢性肾衰竭防治中最为关键的科学问题。抗肾纤维化新药AKF-PD是本课题组设计的小分子化合物。目前已证实AKF-PD对肾纤维化实验动物模型有良好的抗纤维化疗效。但AKF-PD治疗肾间质纤维化的具体机制尚未完全阐明。目前的研究结果显示AKF-PD(?)(?)抑制(?)NADPH氧化酶的表达和减少活性氧的产生,抑制肾小管细胞凋亡、转分化及成纤维细胞的增殖,下调致纤维化细胞因子的表达,减少病变肾脏基质胶原合成。研究表明炎症反应是肾脏纤维化发病进程中的早期事件,对肾纤维化的发病具有重要作用。但AKF-PD对肾脏局部细胞炎症反应的影响及其作用机制尚不清楚。肾纤维化是个复杂的病理生理过程,需要多种细胞的参与及相互作用,包括肾固有细胞及募集的炎症细胞。肾脏受到多种致肾损伤因子作用后,一方面非致死受损的肾固有细胞本身发生活化、增殖,分泌大量炎症／趋化因子,加重肾损伤；另一方面致死性受损的肾固有细胞发生坏死、凋亡,细胞死亡后作为抗原激活临近炎症细胞,促进炎性细胞分泌炎症因子/趋化因子,扩大炎症反应,进一步加重肾损伤。肾小管上皮细胞是兼有免疫调节作用且生物学功能十分活跃的细胞。作为肾固有细胞的主要组成部分,其在肾脏疾病局部微环境形成及调控中发挥重要作用。研究报道促炎因子TNF-a在肾间质纤维化中表达增加,增加的TNF-a可以加重炎症反应及肾损伤。目的：观察AKF-PD对促炎因子TNF-a诱导HK-2细胞炎症因子及趋化因子表达的影响；进一步探讨AKF-PD对TNF-a诱导HK-2细胞MAPK及NF-κB信号通路的调节作用。方法：将细胞分为空白对照组,TNF-α刺激组,TNF-a+AKF-PD组,TNF-a+DEX组,分别用2mM AKF-PD、1μMDEX预处理HK-2细胞1小时后,加入TNF-a (lOng/ml)继续培养24小时,收细胞上清,用ELISA方法观察AKF-PD对TNF-α刺激的HK-2细胞IL-6、IL-8及MCP-1的影响。将细胞分为空白对照组,TNF-a刺激组,TNF-a+AKF-PD组,TNF-a+MAPKs抑制剂组,分别用2mM AKF-PD预处理HK-2细胞24小时,10pM MAPKs特异性抑制剂(PD98058、SB203580、SP600125)处理HK-2细胞1小时后,加入10ng/ml TNF-a继续培养15分钟,提细胞蛋白,用Western Blot方法检测AKF-PD对p-ERK1/2,p-p38和p-JNK表达的影响。将细胞分为空白对照组,TNF-α刺激组,TNF-a+AKF-PD组,TNF-a+NF-κB抑制剂组,分别用2mM AKF-P D预处理HK-2细胞24小时,10μM NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082处理HK-2细胞1小时后,加入10ng/ml TNF-α继续培养60分钟,提细胞蛋白,用WesternBlot方法检测AKF-PD对细胞内p-IκBα表达的影响。将细胞分为空白对照组,TNF-α刺激组,TNF-α+AKF-PD组,用2mM AKF-PD预处理HK-2细胞24小时后,加入10ng/ml TNF-α继续培养60分钟,提取细胞核蛋白,用Western Blot方法检测AKF-PD对细胞核内P65表达的影响。将细胞分为空白对照组,TNF-α刺激组,TNF-α+AKF-PD组,TNF-α+DEX组,分别用2mM AKF-PD、1μM DEX预处理HK-2细胞24小时后,加入TNF-α (lOng/ml)继续培养60分钟,采用双荧光素酶报告分析系统检测AKF-PD对TNF-α刺激的HK-2细胞NF-κB报告基因转录活性的影响。结果：TNF-α刺激HK-2细胞24小时后,细胞上清中IL-6、IL-8及MCP-1的分泌量明显高于正常组(p<0.05), AKF-PD和DEX预处理HK-2细胞后能够显著抑制细胞上清中IL-6、IL-8及MCP-1的含量(p<0.05)。TNF-α刺激HK-2细胞15分钟后,p-ERK1/2的表达显著上升,AKF-PD和p-ERK1/2特异性抑制剂PD98058均明显抑制ERK1/2的磷酸化(p<0.05)；TNF-α刺激HK-2细胞15分钟后,p-p38的表达显著上升,AKF-PD和p-p38特异性抑制剂SB203580均能有效降低p38的磷酸化(p<0.05)；TNF-α刺激HK-2细胞15分钟后,p-JNK的表达显著上升,AKF-PD和p-JNK特异性抑制剂SP600125均能显著减少JNK的磷酸化(p<0.05)。TNF-a刺激HK-2细胞60分钟后,细胞内p-IKBa的表达显著上升,特异性抑制剂BAY11-7082明显抑制IκBα磷酸化(p<0.05),而AKF-PD对IκBα磷酸化无明显影响。TNF-α刺激HK-2细胞60分钟后,胞核内P65的表达显著上升,AKF-PD明显抑制核内P65的表达,表明AKF-PD阻止P65核移位(p<0.05)。TNF-α刺激HK-2细胞60分钟后,NF-κB报告基因的转录激活显著上升(p<0.05),AKF-PD和DEX预处理HK-2细胞后能够显著抑制NF-κB报告基因的激活(p<0.05)。结论：(1)AKF-PD可抑制TNF-α诱导的肾小管上皮细胞IL-6、IL-8及MCP-1蛋白的表达,AKF-PD在肾小管上皮细胞中发挥抗炎作用。(2) AKF-PD在肾小管上皮细胞中抗炎作用可能是通过阻断MAPK信号通路来起作用,其作用机制可能是抑制ERK1/2、P38和JNK的磷酸化。(3) AKF-PD在肾小管上皮细胞中抗炎作用可能是通过阻断NF-κB信号通路来起作用,其作用机制可能是抑制P65的核移位、NF-κB报告基因的激活。第二章氟非尼酮对小鼠巨噬细胞炎症反应的影响及作用机制研究研究背景：肾脏纤维化发病机制复杂,目前已证实炎症细胞浸润在肾脏的慢性炎症和纤维化过程中发挥重要作用。巨噬细胞是一种多功能的炎症细胞,在肾脏局部炎症反应的免疫防御和免疫功能紊乱中,是一个重要的参与者。有研究发现,浸润到局部肾组织巨噬细胞的数量与纤维化严重程度成正相关,而减少巨噬细胞的数量可以显著改善肾脏纤维化。炎症部位往往同时伴随广泛的细胞坏死,在肾纤维化发生的起始阶段,在外界损伤的作用下,致死性受损的肾固有细胞发生坏死,坏死细胞及其产物会活化临近的炎性细胞及免疫系统,诱导免疫应答,促进炎症因子、趋化因子的合成和释放,进一步加重肾损伤,加速肾纤维化的进程。对于抗肾纤维化新药AKF-PD如何调控细胞坏死后诱导的炎症反应,尤其是对巨噬细胞炎症反应的调控仍不清楚。目的：观察AKF-PD对坏死细胞诱导小鼠巨噬细胞炎症因子及趋化因子表达的影响；进一步探讨AKF-PD对坏死细胞诱导的小鼠巨噬细胞MAPK及NF-κB通路的调节作用。方法：用不同浓度(0个/m1、1.5×106个/m1、3.0×106个/m1、6.0×106个/m1、12.0×106个/m1)坏死细胞刺激小鼠巨噬细胞18小时,收细胞上清,用ELISA方法观察不同浓度坏死细胞对小鼠巨噬细胞TNF-α表达的影响。将细胞分为空白对照组,坏死细胞刺激组,坏死细胞+AKF-PD组,LPS刺激组,用2mM AKF-PD预处理小鼠巨噬细胞1小时后,加入6.0×106个/ml坏死细胞或单独加入500ng/ml LPS继续培养18小时,收细胞上清用ELISA方法观察AKF-PD对坏死细胞刺激小鼠巨噬细胞TNF-α及MCP-1的影响。将细胞分为空白对照组,坏死细胞刺激组,坏死细胞+AKF-PD组,用2mM AKF-PD预处理小鼠巨噬细胞24小时后,加入6.0×106个/ml坏死细胞继续培养15分钟,提细胞蛋白,用Western Blot方法检测AKF-PD对p-ERK1/2、p-p38表达的影响。将细胞分为空白对照组,坏死细胞刺激组,坏死细胞+AKF-PD组,用2mM AKF-PD预处理小鼠巨噬细胞24小时,加入6.0×106个/ml坏死细胞继续培养60分钟,提细胞蛋白,用Western Blot方法检测AKF-PD对细胞内IκBα表达的影响。将细胞分为空白对照组,坏死细胞刺激组,坏死细胞+AKF-PD组,用2mM AKF-PD预处理小鼠巨噬细胞24小时后,加入6.0×106个/ml坏死细胞继续培养60分钟,提取核蛋白,用Western Blot方法检测AKF-PD对细胞核内P65表达的影响。结果：正常对照组小鼠巨噬细胞培养上清中,仅检测到少量TNF-a的表达,不同浓度坏死细胞刺激小鼠巨噬细胞18小时后,细胞上清中TNF-a的分泌量明显高于对照组(p<0.05),且TNF-a的表达随着坏死细胞浓度升高先逐渐增加后降低,其中当坏死细胞浓度为6×106个/m1时培养上清中TNF-α的表达达高峰。6×106个/ml坏死细胞和500ng/ml LPS单独刺激小鼠巨噬细胞18小时后,细胞上清中TNF-a及MCP-1的分泌量明显高于正常对照组(p<0.05), AKF-PD预处理小鼠巨噬细胞后能够显著抑制细胞上清中TNF-a及MCP-1的含量(p<0.05)。6×106个/m1坏死细胞刺激小鼠巨噬细胞15分钟后,p-ERK1/2及p-p38的表达显著上升(p<0.05),AKF-PD明显抑制ERK1/2及p38的磷酸化(p<0.05)。6×106个/ml坏死细胞刺激小鼠巨噬细胞60分钟后,细胞内IκBα的表达显著下降,表明iκBα被降解(p<0.05),而AKF-PD预处理对IκBα降解无明显影响。6×106个/m1坏死细胞刺激小鼠巨噬细胞60分钟后,胞核内P65的表达显著上升,AKF-PD明显抑制核内P65的表达,表明AKF-PD阻止P65核移位(p<0.05)。结论：(1)AKF-PD可抑制坏死细胞诱导的小鼠巨噬细胞TNF-α及MCP-1蛋白的表达,AKF-PD在小鼠巨噬细胞中发挥抗炎作用。(2) AKF-PD在小鼠巨噬细胞中抗炎作用可能是通过阻断MAPK信号通路来起作用,其作用机制是抑制ERK1/2和P38的磷酸化。(3) AKF-PD在小鼠巨噬细胞中抗炎作用可能是通过阻断NF-κB信号通路来起作用,其作用机制是抑制P65的核移位。