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家蚕是既是理想模式生物,又是重要的经济昆虫。应用转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白有着广阔的前景。
本文选择了狂犬病病毒核蛋白(RVNP)、狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)和人溶菌酶蛋白(hLYZ)作为外源基因,再连接到家蚕丝腺特异性启动子后,成功构建了转基因载体,通过显微注射法导入家蚕早期卵中,并分析其整合情况及外源基因的表达情况。
本研究构建A3启动子驱动EGFP报告基因和Ser1启动子驱动狂犬病病毒N基因的piggyBac表达载体(pBSer1RVNP-A3EGFP),利用昆虫卵可视化自吸式外源基因导入法导入家蚕的早期卵中,依靠EGFP报告基因检测转基因家蚕阳性个体,获得了26种在中部丝腺细胞中特异表达N蛋白基因的个体。提取转基因家蚕G2代基因组DNA,用PCR法检测RVNP基因,结果显示RVNP基因已整合进家蚕的染色体。抽提转N蛋白基因的转基因家蚕蚕茧中的蛋白质,用SDS-PAGE和Western blot法证实NP蛋白在转基因家蚕丝腺中特异的表达,重组NP蛋白的分子量为63KD,与理论值相符。
本研究还构建两个转基因载体:pBSer1GP-A3EGFP载体和pBF1c-LRVGP-A3EGFP载体。pBSer1RVGP-A3EGFP载体是由A3启动子驱动EGFP报告基因和Ser1启动子驱动狂犬病病毒G基因的piggyBac表达载体;pBFlcRVGP-A3EGFP载体是由A3启动子驱动EGFP报告基因和Flc-L启动子驱动狂犬病病毒G基因的piggyBac表达载体。利用昆虫卵可视化自吸式外源基因导入法导入家蚕的早期卵中,依靠EGFP报告基因检测转基因家蚕阳性个体,获得的阳性个体分别为3种和5种。提取转基因家蚕G2代基因组DNA,用PCR法检测RVGP基因,结果显示RVGP基因已整合进家蚕的染色体。抽提转G蛋白基因的转基因家蚕蚕茧中的蛋白质,用SDS-PAGE证实GP蛋自在转基因家蚕丝腺中特异的表达,重组GP蛋白的分子量为71.5KD,与理论值相符。
本研究还构建了以A3启动子驱动EGFP报告基因和Ser1启动子驱动人溶菌酶(hLYZ)基因的piggyBac表达载体(pBSerlhLZY-A3EGFP),利用昆虫卵可视化自吸式外源基因导入法导入家蚕的早期卵中,依靠EGFP报告基因检测转基因家蚕阳性个体,获得了9种能在中部丝腺细胞中特异表达hLYZ蛋白基因的个体。