论文部分内容阅读
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,具有血管丰富、侵袭性生长、术后易复发等特性。迄今为止,胶质瘤的发病机制仍不清楚,因此亟待发现能够早期诊断和评估胶质瘤预后的新的生物学标记物。食管癌相关基因-4(Esophageal cancer related gene-4, ECRG4)最初被Bi等人识别并克隆,他们发现与正常成人食管上皮相比,食管鳞癌组织和细胞系中ECRG4的表达明显降低。近年来相继有研究显示,ECRG4在人体多种正常组织中高表达,而在肿瘤组织中表达下调,因此认为其可能是一种新的候选肿瘤抑制基因。本实验首先应用实时PCR检测ECRG4 mRNA在人脑胶质瘤及其周围正常脑组织中的表达差异,证实ECRG4 mRNA在胶质瘤中的表达显著下调。进而通过基因转染的方法建立ECRG4过表达的胶质瘤细胞模型,通过体外实验研究ECRG4在抑制肿瘤增殖、迁移和侵袭中的作用。研究结果如下:1实时PCR检测胶质瘤中ECRG4 mRNA的表达收集10组配对新鲜人脑胶质瘤及其邻近的正常脑组织标本,应用实时PCR检测ECRG4 mRNA的表达。结果显示:与正常配对脑组织相比较,10例胶质瘤组织的ECRG4 mRNA表达量均不同程度下降,其中除1例毛细胞型星形胶质细胞瘤下降不明显外,其余9例ECRG4 mRNA的表达显著减低,与正常组织比较均大于2倍。提示ECRG4 mRNA在人脑胶质瘤组织中表达下调。2 ECRG4在U251细胞系中的稳定转染及筛选鉴定利用脂质体转染法将携带有ECRG4全长基因的真核表达载体pEGFP-N1稳定转染靶细胞,经G418筛选获得7个稳定转染细胞克隆。将获取的单克隆进行ECRG4 mRNA和蛋白的表达鉴定。实时RT-PCR结果显示,稳定转染的阳性细胞克隆ECRG4 mRNA均呈高水平表达。Western blot检测显示转染细胞克隆ECRG4呈高水平表达。3 MTT法和平板克隆形成实验检测ECRG4过表达对U251细胞增殖能力的影响应用MTT法测定转染前后细胞的增殖速度,并绘制生长曲线。结果显示过表ECRG4的克隆pEGFP-ECRG4-5和pEGFP-ECRG4-7细胞增殖能力明显抑制。平板克隆形成实验结果显示:与对照克隆细胞相比较,过度表达ECRG4的细胞克隆形成明显减少,统计学分析显示P < 0.05。4 ECRG4过表达对U251细胞迁移和侵袭能力的影响应用transwell小室培养体系,用FN包被聚碳酸酯膜,transwell小室下室中加入含10% NBCS的RPMI 1652作为趋化因子,孵育12小时后计数迁移细胞数;结果显示与对照组比较,ECRG4过表达的胶质瘤细胞迁移细胞数量显著减少(P < 0.05)。Matrigel包被Boyden小室检测细胞的侵袭能力,结果显示与阴性对照细胞相比较,过表达ECRG4的细胞侵袭能力明显降低(P < 0.05)。总之,本研究为ECRG4作为肿瘤抑制基因提供了新的实验依据,也为胶质瘤的治疗提供了一个新的靶点。