前言　　原位肝移植是治疗终末期肝病(endstageliverdisease，ESLD)的有效方法，供体短缺是目前肝移植面临的难题之一。上世纪90年代以来心脏死亡供体(donationaftercardiacdeath，DCD)逐渐得到重视，供体数量不断增加。2010年3月，中华人民共和国卫生部与中国红十字总会共同启动了人体器官捐献试点工作，截至2012年11月15日，全国共完成器官捐献482例，共捐献大器官1300个。两年多以来，DCD的数量稳定增长，临床实践证明心脏死亡器官捐献是符合中国国情的，是切实可行的。　　在临床肝移植中，缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusioninjury，IRI)在热缺血损伤、器官切取、冷保存等过程中发生，是急需解决的一项难题。研究表明，边缘供体，尤其是DCD肝脏对于IRI更加敏感。病理学上看，缺血再灌注损伤以补体沉积，细胞间粘附分子上调，炎性细胞浸润，细胞因子释放为特征。IRI是原发性器官无功能、慢性排斥反应的主要原因，也是导致器官短缺的主要原因之一。目前研究表明肝脏IRI是由内源性免疫分子TLR4介导的氧化应激反应。　　研究表明，促炎因子的过度表达和释放是导致感染性休克病人死亡和移植器官原发无功能的重要原因，单纯阻断某种炎症因子的表达并不能改善感染性休克病人的结局。因此，阻断TLR4通路，进而阻断其下游多种促炎因子的释放能够提供一种更加有效的抑制炎症因子释放的方法，能够更加有效地缓解缺血再灌注损伤。对于肝移植病人来说，通过阻断TLR4通路，阻断内外源性配体对TLR4蛋白结合，对于保护供肝活性，帮助病人度过肝移植后的高炎症反应期，提高病人生存率意义重大。　　目的　　本研究建立小型猪心脏死亡模型，研究在心脏死亡过程中肝脏形态改变、TLR4通路相关分子、相关调节分子及炎症因子表达情况化，探讨TLR4通路相关分子表达和DCD供肝损伤的关系。　　实验方法　　一、实验对象　　实验用猪10头（杜洛克、长白、大白三元杂交猪，由沈阳农业大学提供），3-4月龄，体重25～30kg，雌雄不限。　　二、实验方法　　1、建立小型猪可控性心脏死亡动物模型，分别在动物麻醉后、达到心脏死亡标准时、达到心脏死亡标准以后每隔5min，直到心脏死亡30min取材，分别记为对照、热缺血0min、热缺血5min、热缺血10min、热缺血15min、热缺血20min、热缺血25min和热缺血30min。　　2、利用RT-PCR检测TLR4、TRAF6、MCP-1、ICAM-1、MPO基因mRNA在细胞和组织水平的表达。　　3、利用Westernblot检测肝组织中TLR4、TRAF6、MCP-1、ICAM-1、MPO、p65蛋白表达含量。　　4、利用ELISA技术检测TNF-α、IL-6表达情况。　　5、利用HE染色观察DCD供肝形态学变化。　　结果　　1、TLR4通路相关分子TLR4、TRAF6、NF-κB表达随着热缺血时间的延长，这些分子mRNA表达增高，在缺血25min达到高峰，单因素方差分析可知，与对照组相比，其余各组蛋白表达增高，差异有统计学意义(p＜0.05)。TLR4蛋白随热缺血时间表达增高，TRAF6和p65呈先降低后增高趋势，与对照组相比，其余各组蛋白表达增高，差异有统计学意义(p＜0.05)。　　2、主要调节分子ICAM-1、MCP-1和MPO表达随着热缺血时间的延长，这些分子mRNA表达增强，分别在热缺血20min、热缺血30min和热缺血15min达到高峰，单因素方差分析可知，与对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。随着热缺血时间的延长，这些调节蛋白表达量增多，分别在热缺血20min、热缺血25min和热缺血25min达到高峰，单因素方差分析可知，与对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)　　3、主要炎症因子TNF-α、IL-6表达随着热缺血时间的延长，这两种炎症因子表达增高，在热缺血20min时达到最高，分别为817±320pg/ml和3056±560pg/ml。单因素方差分析可知，与对照组相比，炎症因子升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。　　4、DCD供肝HE染色光镜下可见随着热缺血时间的延长，肝细胞水肿逐渐加重，并且伴有不同程度的充血，到热缺血20min时，水肿明显加重，伴有程度不等的炎性细胞浸润。热缺血25min后可见肝细胞水肿明显加重，部分肝细胞气球样变性。　　结论　　肝细胞损伤、炎症细胞浸润与TLR4通路分子表达增高，炎症因子、粘附分子大量表达有关。