论文部分内容阅读
背景肺癌为目前全球范围内死亡率排名第一位的恶性肿瘤。在最近的几十年来,我国肺癌的发病率以及死亡率居高不下,据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)评估,2025年我国肺癌患病人数将居全球之首。Ⅰ期肺癌患者若立即进行手术切除,则其5年生存率可达92%,而未经治疗的Ⅰ期肺癌患者则将在5年内死亡,而Ⅰ～Ⅳ期肺癌患者的总体5年生存率仅为15%左右。所以,早期诊断以及治疗能够有效提高肺癌患者的存活率。miRNA (microRNAs)为具有多种生物学功能的小分子RNA,在生物体生长发育、生理功能特别是在恶性肿瘤的发生和发展过程中有重要作用,因此日益成为广大生命科学研究工作者们探索的热点内容。miRNA与人类恶性肿瘤形成的多条信号传导通路密切相关,既可作为癌基因参与肿瘤的发生和发展,亦可发挥抑癌基因的功能抑制肿瘤的生成和恶化。目前的研究已证实,人体中约有三分之一以上的基因是由miRNA所调节的。miRNA经由对其靶基因进行调控,参与人体生理过程调节,同时与人类多种恶性肿瘤,如胃癌、乳腺癌、肺癌等的发生和发展过程有关。本文就近年来关于miRNA与肺癌关系的文章予以综述并对miR-34a下调SIRT1影响肺癌细胞增殖及凋亡进行实验证实,旨在加深对肺癌发生和发展的分子机制以及病理变化的认识,为增加肺癌治疗手段、有效提高肺癌诊疗水平奠定理论基础。目的本文通过研究miR-34a以及SIRTl在人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及意义,以及miR-34a在抑制NSCLC细胞增殖、促凋亡以及调控细胞周期的作用机制,旨在为开发新的治疗NSCLC药物以及制定NSCLC临床治疗新方案提供实验依据。方法(1)采集50例NSCLC患者的癌组织样本以及10例相应癌旁正常组织样本,通过运用荧光定量PCR方法检测上述样本中miR-34a和SIRT1 mRNA的转录,同时通过蛋白质免疫印迹(western blot)法明确SIRT1蛋白的表达情况,分析miR-34a和SIRT1表达与NSCLC患者临床病理参数的相关性。(2)将miR-34a模拟物(miR-34a mimic)转染人NSCLC H1299细胞；荧光定量PCR检测细胞中miR-34a的转录；运用MTT法检测miR-34a对细胞增殖的影响；Annexin V-FITC/PI双染法检测miR-34a对细胞凋亡的影响；用流式细胞术检测miR-34a对细胞周期的影响；用Transwell小室法检测miR-34a对细胞的侵袭能力的影响；细胞划痕实验检测miR-34a对细胞迁移能力的影响。(3)将H1299细胞随机分为2大组：即①mimic阴性对照组：转染相同浓度的miR-mimics-mock, miR-34a mimic组：转染miR-34a mimic;②抑甲制剂阴性对照组：不加入miR-34a抑制剂,miR-34a抑制剂组：加入40nmol/LmiR-34a抑制剂。荧光定量PCR检测各处理组中miR-34a的表达情况；运用BrdU细胞增殖实验检测各组细胞的增殖情况；western blot法检测各处理组中SIRT1蛋白的表达情况。结果(1) NSCLC患者的癌组织样本中miR-34a的表达较相应癌旁正常组织明显降低;NSCLC患者的癌组织样本中SIRT1 mRNA及相应蛋白的表达较相应癌旁正常组织明显增高；miR-34a的表达与NSCLC患者的性别、年龄、pTNM分期、病理类型以及组织病理学分级无关,而与患者是否淋巴结转移有关。SIRT1的表达与NSCLC患者的性别、年龄以及病理类型无关,而与患者的pTNM分期、是否淋巴结转移以及组织病理学分级有关。(2)miR-34a能皂够抑制H1299细胞的增殖,诱导其凋亡,且能够将NSCLC H1299细胞周期阻滞在G1期,从而对其细胞周期产生影响；miR-34a能够抑制H1299细胞侵袭；miR-34a对H1299细胞的迁移能力具有抑制作用。(3)转染miR-34a mimic后H1299细胞增殖活性显著降低,加入miR-34a抑制剂时其增殖活性明显增高,表明miR-34a对人NSCLC H1299细胞的增殖活性具有抑制作用；转染miR-34a mimic后H1299细胞中SIRT1蛋白的表达明显降低,加入miR-34a抑制剂时其表达量显著增高。结论miR-34a可能经由抑制SIRT1的表达来发挥抑制NSCLC H1299细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用。提示miR-34a可能为一种抑癌基因参与了NSCLC的发生和发展过程,可将其作为肿瘤标志物应用于NSCLC临床检测、预后判断以及靶向治疗中。