中药是中国医药文化的重要组成部分,因其具有广泛的保健和治疗作用,愈加受到国际认可。但是,中药在走向国际化和现代化的道路上仍然遇到诸多限制,其质量不稳定是主要原因。其中,中药中农药和重金属含量超标是影响其质量的两大症结。为了加强中药的质量控制,促进中药的现代化,农药残留和重金属的检测也日益成为广大医药工作者的研究热点。目前,针对中药中农药残留检测的方法主要基于色谱和质谱技术,例如气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用技术以及高效液相色谱-质谱联用技术;针对中药中重金属污染检测的方法主要基于光谱技术,例如紫外分光光度法、原子吸收分光光度法、原子荧光光谱法和电感耦合等离子体光谱法。以上所述的这些技术的准确度和灵敏度均较高,很适合作为确证方法于实验室使用。然而,这些技术具有成本昂贵和操作复杂的缺点,很大程度上限制了其在现场大样本筛选方面的应用。化学发光(chemiluminescence,CL)作为无需外部光源的光谱技术,具有操作简单、成本低、灵敏度高和线性范围宽等优势,可用于现场筛查中药中的农药残留和重金属。本文将CL分析与免疫传感技术相结合,基于多种CL的探针,例如天然酶、金属纳米粒子、金属氧化物纳米花和碳-金属纳米复合物,构建了多种用于中药中农药残留检测的免疫传感器;基于免标记分析策略,发展了一种用于中药中重金属检测的免疫传感器。具体的研究内容包括以下几个方面:1、基于双酶体系构建CL动力学分辨免疫分析方法同时检测人参和西洋参中甲基对硫磷和吡虫啉本研究将可同时结合甲基对硫磷和吡虫啉的双功能抗体作为唯一的免疫识别试剂,将具备不同发光动力学特征的CL标记物(辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP))标记于甲基对硫磷和吡虫啉的半抗原上作为CL信号探针,构建了 CL动力学分辨免疫分析新方法。经研究发现,HRP-鲁米诺-过氧化氢体系和ALP-金刚烷二氧丁环磷酸盐体系有着截然不同的CL动力学。当加入共反应剂激发后,前者化学信号可在0.6 s时达到峰值,后者随着时间的增加,其化学信号持续增加,当1000 s后两者之间的信号干扰几乎可以完全避免。故而,本研究选择1000 s作为后者信号的采集时间。本研究基于可同时捕获甲基对硫磷和吡虫啉的双功能抗体作为识别试剂,通过竞争免疫分析模式,对这两种农药进行检测,可在0.6 s和1000 s时收集两待检物的CL信号。甲基对硫磷和吡虫啉的线性范围均是1.0-500 ng/mL,检出限均为0.33 ng/mL(S/N=3)。此新型分析方法成功应用于人参和西洋参的实际样品检测,回收率为 80-118%。2、基于二氧化锰纳米花构建双响应免疫层析试纸条检测黄芪和茯苓中的毒死蜱本研究采用高锰酸钾对聚二甲基二烯丙基氯化铵的强氧化作用,成功合成了外观均一的二氧化锰纳米花(MnO2 nanoflowers,MnO2 NFs)。与铂金双金属纳米粒子、铂钯双金属纳米粒子、普鲁士蓝纳米棒和石墨烯氧化物这四种类酶纳米材料相比,MnO2NFs可明显增敏鲁米诺-过氧化氢体系的CL信号。经过研究发现,Mn02 NFs是基于其作为强氧化剂的氧化作用,而非类酶催化效果来增敏CL信号。由于MnO2 NFs同时具有深棕色和CL增敏效果,其可用于构建比色法-CL法的双效应的免疫层析试纸条。将毒死蜱的完全抗原固定与试纸条的硝酸纤维膜上,作为检测区。利用吸附作用,将MnO2 NFs标记于毒死蜱单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)上作为CL信号探针。经过竞争模式的免疫反应后,Mn02 NFs-毒死蜱McAb被毒死蜱完全抗原捕获于试纸条的检测区。MnO2 NFs的颜色为深棕色,其在检测区的颜色反应可用肉眼观察直接得到,可用于半定量检测毒死蜱。通过在检测区激发MnO2 NFs-鲁米诺-过氧化氢CL体系,检测CL信号,对毒死蜱进行进一步的特异性定量检测。其线性范围为0.1-50 ng/mL,检出限为0.033 ng/mL(S/N=3)。此新型分析方法可成功用于黄芪和茯苓的实际样品检测,回收率为90-120%。3、基于鲁米诺还原金纳米粒子构建空间分辨免疫层析试纸条同时检测栀子和桑叶中的甲基对硫磷和甲氰菊酯本研究基于鲁米诺对氯金酸的弱还原性,成功地合成了鲁米诺还原金纳米粒子(luminol reduced gold nanoparticles,LuReGNPs),此纳米粒子既具有普通金纳米粒子的红色特性,还具备发光试剂鲁米诺的化学信号响应特点。将LuReGNPs分别标记于甲基对硫磷McAb和甲氰菊酯McAb上作为空间分辨的信号探针(LuReGNPs-甲基对硫磷McAb和LuReGNPs-甲氰菊酯McAb),将甲基对硫磷的完全抗原和甲氰菊酯的完全抗原分别固定与试纸条的硝酸纤维膜上,作为检测区T1和检测区T2。竞争免疫反应结束后,LuReGNPs-甲基对硫磷McAb和LuReGNPs-甲氰菊酯McAb分别被其对应的完全抗原捕获于检测区T1和检测区T2。由于LuReGNPs的聚集于检测区T1和T2,其颜色的深浅可以轻易的被肉眼记录作为半定量检测甲基对硫磷和甲氰菊酯的颜色信号。随后,在两个检测区分别激发鲁米诺-过氧化氢的CL体系后,收集检测区T1和T2的CL信号,可进一步精确检测此两种待检物。甲基对硫磷和甲氰菊酯的线性范围为0.5-200 ng/mL和0.3-200 ng/mL,检出限分别为0.17和0.10 ng/mL(S/N=3)。此新型分析方法成功用于栀子和桑叶的实际样品检测,回收率为95-111%。4、基于石墨相的氮化碳-铁酸铋纳米复合物构建免疫层析试纸条同时检测丹参和党参中的毒死蜱和西维因本研究基于溶胶凝胶煅烧法成功地制备了石墨相的氮化碳-铁酸铋纳米复合物(g-C3N4-BiFeO3 nanocomposites,g-C3N4-BiFeO3NCs),该纳米复合物具有类酶催化效果而可明显增强鲁米诺-过氧化氢CL体系的信号强度。利用石墨相的氮化碳-铁酸铋纳米复合物的纳米吸附效果,将毒死蜱McAb和西维因McAb分别吸附于此纳米复合物上,作为空间分辨的CL信号探针。将毒死蜱的完全抗原和西维因的完全抗原分别固定于试纸条的硝酸纤维膜上,作为检测区T1和T2。当竞争模式的免疫反应充分完成后,T1上的毒死蜱的完全抗原和T2上的西维因的完全抗原,可特异性结合其对应的示踪抗体。g-C3N4-BiFeO3NCs的深棕色可作为此双组份试纸条的半定量颜色信号,而其对鲁米诺-过氧化氢CL体系的增敏效果可以作为精确定量的CL信号。毒死蜱和西维因的线性范围为0.1-60 ng/mL和0.1-40 ng/mL,检出限均为0.033 ng/mL(S/N=3)。此新型分析方法成功用于丹参和党参的实际样品检测,回收率为81-119%。5、基于自增敏策略构建免标记免疫分析法检测人参和丹参中的铜本研究构建了一种极便利、较快速、较灵敏和低成本的免疫方法,用于检测中药样品的重金属(以铜Cu(Ⅱ)为例)。首先将样品中的Cu(Ⅱ)充分和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)反应,形成Cu(Ⅱ)-EDTA络合物。采用Cu(Ⅱ)-EDTA络合物的McAb作为识别试剂,免疫结合完成后利用蛋白破坏试剂尿素作为重金属离子溶出剂。Cu(Ⅱ)-EDTA络合物从抗体中溶出成为游离态后,利用其对鲁米诺-过氧化氢体系增敏效果,进行免标记的CL免疫传感器的构建。该免疫传感器基于抗体识别机制和鲁米诺-过氧化氢体系对重金属的敏感机制的双重特异性,可实现对Cu(Ⅱ)较高特异性检测。在此方法中,Cu(Ⅱ)的检测范围为1.0-1000 ng/mL,检出限为0.33 ng/mL(S/N=3)。该法可成功用于人参和丹参的实际样品检测,回收率为82-113%。综上所述,本论文将CL免疫分析与传感器技术相结合,基于多种高效的CL体系探针,例如 HRP 和 ALP、Mn02NFs、LuReGNPs 和 g-C3N4-BiFeO2NCs,发展了多种用于中药中农药残留检测的免疫传感器,并进一步研究基于多探针分辨模式(CL动力学模式)和空间分辨模式的传感器集成技术,构建了三种同时快速检测的多组分免疫传感器。和传统的ELISA法及其它报道的免疫传感器相比,本论文构建的各种新型的免疫传感器有望对农药残留检测实现更高的分析灵敏度;信号检测所用设备构造较为简单,有望实现小型化、便携化,这非常有利于现场分析;传感器的阵列化集成在多样品和多残留同时分析中更是有着显而易见的优势。此外,本论文基于CL免疫分析,设计了一种用于中药中重金属检测的传感器。论文中采用重金属离子的McAb作为捕获试剂,利用重金属络合物对CL体系增敏效果,进行免标记的CL免疫传感器的构建,用于中药中的重金属的快速检测。和已报道的间接免疫分析法相比,本论文研制的直接CL免疫传感器,可以缩短分析时间,提高分析效率。和传统的光谱技术相比,该方法可以降低分析成本,利于大量样本的快速筛查。